《Journal of Virology》：Identification of thermostability-enhancing mutations in H9N2 avian influenza virus hemagglutinin
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本研究通过对H9N2禽流感病毒（AIV）血凝素（HA）蛋白进行体外定向进化筛选，鉴定出L29I、N133S、N210D等多个可显著增强HA热稳定性的突变位点。研究发现HA稳定性与受体结合特异性、复制动力学、酸耐受性等关键病毒功能间存在复杂相互作用。该工作不仅填补了H9N2病毒HA不稳定的分子机制认知空白，也为理解HA介导的病毒感染机制、开发更有效的疫苗和防控策略提供了新视角。
引言：H9N2禽流感病毒的持续威胁与研究背景
H9N2禽流感病毒（AIV）对全球家禽业构成持续性威胁，造成重大经济损失，并因其已被证实的跨物种传播能力而对人类健康构成潜在风险。该病毒可感染多种哺乳动物宿主，包括猪、犬、马、蝙蝠、貂、鼠兔和人类。尽管人感染H9N2病毒仍不常见，也未观察到持续的人传人现象，但在雪貂模型中的实验研究已证明H9N2病毒存在空气传播的可能性。血凝素（HA）作为流感病毒的主要表面糖蛋白，是决定病毒宿主范围、传播能力和人类大流行潜力的关键因子，这些特性与其受体结合亲和力和整体稳定性密切相关。HA蛋白被裂解为HA1和HA2亚基，协调病毒进入过程：HA1通过唾液酸受体介导与宿主细胞的附着，决定宿主嗜性；而HA2则经历酸催化的构象重排，触发病毒与宿主细胞膜的融合，从而启动感染。HA稳定性是关键病毒学特性，通过实现对膜融合的精确控制来增强流感病毒对哺乳动物的适应性，从而促进空气传播，并突显了其在跨物种传播过程中作为选择瓶颈的功能。H9N2病毒在亚洲、中东、北非和西非的家禽和野鸟宿主中广泛传播。鉴于HA蛋白在病毒复制、稳定性和传播中的关键作用，其生物物理特性是决定病毒适应性的关键因素，使得HA稳定性尤为重要。事实上，在HA中携带人类型受体结合突变的工程化H5N1病毒未能在雪貂中实现空气传播；然而，获得诸如T318I和H110Y等补偿性突变，增强了HA热稳定性并降低了激活的pH阈值，从而恢复了空气传播能力。升高的温度可能促进HA构象变化，即使在接近中性pH条件下也能促进从非融合状态向融合能力的转变，从而消除了对严格酸性激活的需求。此外，HA的热稳定性对流感疫苗开发具有重要意义。将增强的热稳定性工程化到H1N1和H3N2疫苗株中，可产生更稳定有效的免疫原，在不同储存和使用条件下表现出更高的稳定性。尽管HA稳定性在AIV中的重要性已被认识，但控制H9N2病毒热稳定性的HA突变仍不清楚。
材料与方法：筛选与验证HA热稳定突变的技术路线
本研究采用综合策略来鉴定和验证H9N2病毒HA中的热稳定性增强突变。细胞与病毒方面，使用了Madin-Darby犬肾（MDCK）、非洲绿猴肾（Vero）和人胚胎肾293T（HEK293T）细胞。野生型（WT）病毒A/chicken/Baise/0701/2019(H9N2)（BS19）在37°C下丧失了血凝能力。通过将BS/19 HA蛋白的胞外域（残基19?530）划分为四个重叠区域，利用易错PCR（epPCR）和定点突变相结合的方法构建了突变质粒文库，旨在每个区域引入1-3个氨基酸的随机突变。随后，使用基于质粒的反向遗传学系统，在PR8（H1N1）病毒内部基因的背景下，拯救并扩增了这些HA突变病毒，生成了四个对应的突变病毒文库（L1, L2, L3, L4）。为了筛选具有增强热稳定性的HA突变体，对突变病毒文库在48°C下进行了连续三轮的热处理（10分钟、30分钟、60分钟），以富集热稳定突变体。热处理后，通过噬斑纯化从每个文库中随机分离克隆，并进行扩增。通过HA测定、TCID50测定评估病毒的血凝活性和感染性滴度。此外，还进行了定点突变以验证从随机库中鉴定出的热稳定性增强突变，并拯救了携带单个或组合突变的病毒。通过体外多步生长曲线评估了所鉴定HA突变对病毒复制动力学的影响。HA热稳定性测定通过在48°C加热块中孵育不同时间后进行。还进行了噬斑测定、红细胞洗脱测定以研究洗脱动力学，以及酸稳定性测定以评估病毒在不同pH条件下的稳定性。受体结合特异性测定使用生物素化的唾液酸糖聚合物（3‘SLN和6’SLN）通过固相结合测定法进行。所有统计分析均使用GraphPad Prism 8软件进行。
结果：HA热稳定突变的鉴定、验证与功能表征
1. 基于epPCR诱变策略的HA突变文库构建
前期研究表明，H9N2 AIV在45°C孵育40分钟后，HA活性和热稳定性显著降低。为了系统筛选BS19 HA胞外域中可改善其热稳定性的新型氨基酸替换，研究采用了epPCR诱变策略。将BS19 HA蛋白的全长胞外域序列（氨基酸19?530）划分为四个重叠区域（L1-L4），每个区域约128个氨基酸。每个HA片段使用特定设计的引物进行epPCR，经优化后，每个库的随机克隆测序确认每个HA片段的突变频率为1-3个氨基酸替换。epPCR产物作为大引物，通过定点突变方法替换病毒拯救质粒载体中的WT HA序列，从而创建了四个不同的质粒库。随后，利用PR8遗传背景的反向遗传学系统拯救和扩增了突变病毒，生成了四个对应的突变病毒文库。
2. HA热稳定突变体的筛选与初步富集
为了分离表现出增强热稳定性的HA突变体，对突变病毒文库进行了连续热处理。首先评估了四个突变病毒文库在48°C处理10分钟后的灭活动力学，结果显示感染性滴度显著降低（约5 log10单位），HA滴度降低了32至128倍。随后进行的三轮热处理（10分钟、30分钟、60分钟）进一步富集了热稳定突变体。经过第三轮热处理后，四个突变病毒文库（L1-60, L2-60, L3-60, L4-60）表现出比原始文库显著增强的热稳定性，其中L3-60和L4-60突变文库的热稳定性高于L1-60和L2-60。
3. 热稳定HA突变体的分离、测序与突变鉴定
经过热选择后，对富集了热稳定变体的L1-60、L2-60、L3-60和L4-60病毒文库进行噬斑纯化，从每个文库中随机挑选了12个噬斑，共获得48个分离株。热稳定性评估显示，大多数突变病毒在48°C下比rg-WT病毒具有更高的热稳定性。对来自四个突变病毒文库的11个最具热稳定性的病毒的HA序列进行分析，发现了一系列氨基酸替换，它们可能构成了观察到的稳定性增加的基础。鉴定出的突变分布在HA蛋白的不同位置：L1文库包含A118V和N133S（位于受体结合域RBD的130环）；L2包含N210D（位于RBD的220环）；L3包含G266R和D387N（位于HA茎部）；L4包含A423T和L29I/A423T/E509G（位于HA茎部）。其中，N210D、D387N和A423T是最常观察到的突变。
4. HA热稳定突变的功能验证与热稳定性评估
为了确认病毒热稳定性的增加可归因于所鉴定的HA突变，将每个突变单独引入BS19病毒的HA基因中，拯救了一系列重配突变病毒。对拯救的病毒（rg-L29I, rg-A118V, rg-N133S, rg-N210D, rg-G266R, rg-D387N, rg-A423T, rg-E509G, rg-A423T/E509G）进行48°C不同时间暴露处理。病毒热稳定性通过测量残余感染力和HA活性来评估。结果显示，rg-WT和rg-A118V突变体在加热后迅速丧失感染力和血凝能力。相反，携带N133S、N210D、G266R或D387N单点突变的病毒表现出比rg-WT显著增强的热稳定性。A423T和E509G单突变仅赋予微小的稳定性增益；然而，当在rg-A423T/E509G双突变体中组合时，观察到热稳定性的显著改善，表明这两个位点之间存在明显的协同作用。
5. 受体结合特异性：维持人类型受体偏好
接下来评估了所鉴定的HA突变是否影响病毒受体结合特异性。使用固相结合测定法，利用生物素化的唾液酸糖聚合物（3‘SLN和6’SLN）进行评估。对照病毒CA/04（H1N1）特异性结合6‘SLN，GD1189（H5N1）病毒仅结合3’SLN。与人类型受体偏好一致，rg-WT病毒对6‘SLN显示出强结合，但对3’SLN的结合可忽略不计。将热稳定性增强的HA突变引入BS19/PR8背景后，并未改变这种受体偏好：所有突变病毒都保持了对6‘SLN的强结合亲和力，没有检测到对3’SLN的结合增加。这些结果表明，增强热稳定性的HA突变不会损害H9N2病毒的人类型受体结合特异性。
6. HA热稳定突变对HA活性的影响
先前研究表明，BS19病毒在SPF鸡蛋中连续传代后出现了HA N141K适应性突变，该突变在37°C下恢复了HA活性并改善了病毒热稳定性。本研究试图确定所鉴定的HA热稳定突变是否同样影响H9N2病毒在37°C下的HA活性。在室温和37°C下进行的HA测定显示，rg-WT在室温下表现出强大的HA活性，但在37°C下活性消失。相反，携带热稳定HA突变的病毒在室温和37°C下都保留了有效凝集鸡红细胞的能力。尽管在37°C下HA滴度普遍降低，但突变病毒仍表现出可证明的血凝活性。
7. HA热稳定突变对病毒复制动力学的影响
为了评估增强热稳定性的HA突变是否影响病毒复制效率，在MDCK细胞中比较了rg-WT和突变H9N2病毒的多步生长动力学。结果显示，携带突变A118V、N133S、N210D、L29I、A423T和E509G的病毒表现出与rg-WT病毒相当的复制动力学和峰值滴度，这表明这些突变体中增加的HA热稳定性并未损害标准细胞培养条件下的病毒适应性。相比之下，D387N突变体和A423T/E509G双突变体表现出减弱的复制谱，达到的峰值滴度显著低于rg-WT病毒，这表明这些特定突变存在潜在的适应性代价。相反，G266R突变体复制达到的峰值滴度在感染后36小时显著高于rg-WT，这表明该突变除了对HA蛋白具有稳定作用外，还可能赋予复制优势。
8. 热稳定突变对HA洗脱动力学的影响
为了研究从热稳定库中鉴定出的HA蛋白突变对H9N2病毒受体结合稳定性的影响，对rg-WT及多个突变病毒进行了红细胞洗脱测定。与rg-WT相比，突变病毒之间观察到病毒洗脱动力学的显著差异。rg-WT病毒表现出快速洗脱特性，大约75%的病毒在1小时内洗脱。几个突变体（rg-N133S, D387N, A423T, E509G, 和 A423T/E509G）显示出与rg-WT相似的洗脱谱。相反，携带突变L29I、A118V和N210D的病毒表现出显著受损的洗脱效率。rg-A118V突变体在3小时后仅达到50%的洗脱，而rg-L29I在7小时内结合逐渐减少。最值得注意的是，rg-N210D在8小时内保持稳定结合，洗脱极少，与rg-WT相比洗脱效率大幅降低。这些发现表明，特定突变（L29I, A118V, N210D）通过可能增加HA的结构刚性或降低其从唾液酸受体的解离速率，增强了HA-受体结合的稳定性。
9. 热稳定突变对酸稳定性的影响
与rg-WT病毒相比，L29I、A118V、N133S、N210D、G266R、D387N、A423T、E509G和A423T/E509G突变病毒表现出更高的酸稳定性，这表明这些热稳定突变也可能影响HA蛋白在病毒进入过程中遇到的低pH环境下的反应。具体而言，rg-WT、D387N、A423T、A118V、N133S和E509G在pH 6.5时活性迅速下降。rg-WT病毒滴度下降了7.50 log10单位并失去HA活性，而L29I、D387N、A423T、A118V、N133S和E509G保持了HA活性，在较低pH下滴度逐渐降低，表明对酸诱导的灭活有更强的抵抗力。N210D、G266R、L29I、A118V和N133S突变增强了病毒酸稳定性，特别是N210D突变，当其被引入rg-WT时赋予了强大的酸稳定表型。
讨论：HA稳定性的复杂作用与潜在意义
低HA稳定性对H9N2病毒生物学的影响仍然是一个关键研究领域。本研究通过整合epPCR、定点突变和反向遗传学策略，创建并表征了多样化的H9N2 HA变体库，鉴定出包括L29I、N133S、N210D、G266R、D387N单氨基酸替换和A423T/E509G双突变在内的一系列可增强HA高温热稳定性的突变。对携带热稳定突变的H9N2 HA变体的分析揭示了HA稳定性与酸耐受性之间复杂的相互作用。对已识别突变空间分布的分析显示，N133S和N210D位于HA的受体结合域内，而G266R、D387N、A423T和E509G位于HA茎部区域。适应性突变L29I也位于茎部结构域内。这些发现表明，HA热稳定性由蛋白质球状头部和茎部区域的残基共同调节，暗示了控制热稳定性的结构元素之间存在复杂的相互作用。2013年以来，中国流行的H9N2病毒显示出对人类型受体亲和力增加的趋势。本研究关注的BS19 HA尤其相关，因为它已积累了多种人类适应性突变，导致对人类型受体有明显的偏好。重要的是，本研究的HA热稳定突变体保持了对α-2,6唾液酸受体的优先结合，而没有同时增加对α-2,3受体的结合。这一发现表明，可以在不损害人类受体特异性的情况下实现增强的热稳定性。对H5流感病毒的先前研究表明，虽然能够实现人类型受体结合的突变可能损害HA稳定性，但在适应过程中获得的补偿性突变对于恢复稳定性至关重要。这些稳定突变同时降低了HA在酸性内体中发生构象变化和膜融合所需的pH阈值。通过促进HA在更高pH下介导的融合，此类突变有助于病毒进入和随后的传播。鉴于HA在不同流感亚型间的结构和功能保守性，H9N2 HA中鉴定的热稳定突变可能通过类似机制发挥作用。本研究发现，特定突变（L29I, A118V, N210D）增强了HA-受体结合的稳定性，可能是通过增加HA的结构刚性或降低其从唾液酸受体的解离速率。观察到的洗脱延迟可能源于能够稳定HA三聚体的突变，从而需要更大的神经氨酸酶（NA）活性才能达到与WT相当的洗脱速率。这些见解揭示了热稳定突变如何超越结构稳定化本身，影响病毒受体结合特性。为了评估所鉴定的HA热稳定突变在自然流行的H9N2病毒中的普遍性，对GISAID EpiFlu数据库进行了查询。在人类H9N2分离株中，检测到N210D替换出现在8个分离株中，G266R替换出现在4个分离株中，其中N210D似乎在近期分离株中更为普遍。还在一个雪貂H9N2分离株中鉴定出N210D替换，在一个猪H9N2分离株中鉴定出A423T替换；然而，在任何分析的序列中均未观察到组合的A423T/E509G突变。值得注意的是，这些位点在禽类H9N2毒株中似乎高度保守，这表明这些特定突变在禽类宿主中可能未受到强烈的正向选择。尽管如此，N210D在近期人类H9N2分离株中流行率的明显上升表明其在人类宿主中具有潜在的选择优势，值得进一步研究。
结论与展望
本研究鉴定出可增强H9N2 AIV中HA热稳定性的关键突变，为进一步研究控制H9N2传播的分子机制奠定了基础。虽然稳定的HA蛋白可能在疫苗生产、储存或免疫原性方面提供优势，但未来的研究应侧重于探索基于这些发现开发改进的热稳定流感疫苗的可行性。这项工作填补了对H9N2病毒HA不稳定分子机制的理解空白，为理解HA介导的病毒感染机制、开发更有效的疫苗和防控策略提供了新的见解。
