《Microbiology Spectrum》：Comparative analysis of the lung microbiota in patients with lung cancer, chronic obstructive pulmonary disease, and community-acquired pneumonia
编辑推荐：
本研究首次联合应用培养组学(culturomics)与16S rRNA基因测序技术，深入比较了肺癌(LC)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)与社区获得性肺炎(CAP)患者的肺微生物组特征。研究发现三者肺微生物群在结构、多样性和关键标志性菌属(如Alloprevotella、Abiotrophia、Mycoplasma)上存在显著差异，揭示了疾病特异性微环境对局部菌群的塑造作用，为探索呼吸系统疾病的诊断生物标志物与潜在治疗靶点提供了新证据。
比较分析肺癌、慢性阻塞性肺病和社区获得性肺炎患者的肺微生物群
摘要
呼吸系统疾病是全球重大的公共卫生挑战。大量研究表明，肺部菌群影响着呼吸系统疾病的发生发展，然而，肺部微生物群的变化与不同呼吸系统疾病之间的关系尚不明确。本研究旨在探讨肺癌(LC)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)和社区获得性肺炎(CAP)患者肺部微生物群的特征与差异。研究纳入了114名患者，采用培养组学(culturomics)和16S rRNA基因测序技术，对支气管肺泡灌洗液(BALF)样本进行分析。通过培养组学，共鉴定出168种细菌，且不同疾病间的细菌谱存在差异。测序结果显示，三组患者中占主导地位的门是Bacillota、Bacteroidota、Pseudomonadota、Actinomycetota和Fusobacteriota，这与培养组学的发现一致。值得注意的是，与LC和COPD组相比，CAP组表现出更高的物种丰富度，并且三组间的β多样性存在显著差异。研究还识别出特定的细菌属，例如Alloprevotella、Abiotrophia和Mycoplasma，分别被区分为LC、COPD和CAP组的指示性分类群。通过利用随机森林建模和受试者工作特征(ROC)曲线分析，确定了几种能够区分这些疾病的关键细菌属。该研究强调了LC、COPD和CAP患者肺部微生物群的显著差异，这些差异可能为诊断提供参考，并表明疾病特异性的微环境可能影响局部微生物群落，从而为肺部微生物群与各种呼吸系统疾病之间的关联提供了证据，值得进一步研究。
引言
随着人类微生物组计划的提出和实施，微生物群在疾病中的作用日益受到关注，该领域已开展了广泛的研究。研究表明，肺部存在多种微生物组，它们参与调节宿主的肺部免疫系统并维持肺部稳态。包括肺癌、慢性阻塞性肺疾病、社区获得性肺炎在内的多种呼吸系统疾病，其肺部微生物群组成存在显著差异。这些变化加剧了菌群失调，并导致炎症和微生物群紊乱的恶性循环。
肺癌被认为是全球负担最重的恶性肿瘤之一，常被称为“头号致命癌症杀手”。在中国，其发病率在过去三十年里增长最快。慢性阻塞性肺疾病是全球慢性病发病率和死亡率上升的主要原因，在“健康中国2030”行动计划中被列为防控重点疾病。社区获得性肺炎是全球范围内导致住院和死亡的主要传染病之一，构成了重大的公共卫生挑战。这三种疾病是常见的呼吸系统疾病，各有其独特的发病机制，并且表现出复杂的相互关系。一些研究者提出，炎症诱导的组织损伤可能促进肺癌的发生，而其他研究则发现慢性阻塞性肺疾病病史与肺癌风险增加相关。然而，肺癌、慢阻肺和社区获得性肺炎患者肺部微生物组谱的差异仍有待探索。
在本研究中，我们利用培养组学和16S rRNA测序技术，分析了肺癌、慢阻肺和社区获得性肺炎患者支气管肺泡灌洗液样本中肺部微生物群的特征。我们进行了α和β多样性分析、线性判别分析效应大小(LEfSe)、随机森林模型和受试者工作特征曲线分析。我们的发现丰富了肺癌、慢阻肺和社区获得性肺炎患者的可培养细菌数据库，有助于深入探究宿主-微生物相互作用，并探索各种肺部疾病中关键菌株的相关特征。
结果
参与者的基线特征
研究共纳入114名符合条件的参与者，根据其临床诊断分为三组：42例肺癌，32例慢性阻塞性肺疾病，40例社区获得性肺炎。通过培养组学对这些参与者的BALF样本进行培养和鉴定。随后，对一组最终符合我们质量控制标准（包括足够的剩余体积、足够的DNA浓度并通过文库质量检查）的48个合格样本进行了16S rRNA基因测序。这组样本包括18例肺癌，16例慢阻肺和14例社区获得性肺炎。参与者的基线特征如表1所示。
通过培养组学从BALF中分离细菌的特征
通过在所有114个BALF样本中使用四种不同条件进行培养，共鉴定出3346个菌落，涵盖5个门、13个纲、25个目、39个科、58个属和168个种。其中，在肺癌组中发现了113个物种，在慢阻肺组中发现了109个物种，在社区获得性肺炎组中发现了102个物种。此外，有61个物种在所有三组中均有分离，在肺癌、慢阻肺和社区获得性肺炎组中分别鉴定出29、25和19个独有物种。鉴定出的168个细菌种被归为5个主要门，其中Bacillota、Pseudomonadota和Actinomycetota共同构成了培养菌群的大部分（>85%）。对于分离细菌的分类学分析，我们在不同分类学水平上表征了细菌群落组成。图1C展示了肺癌、慢阻肺和社区获得性肺炎患者肺部微生物群的五个门、前22个优势科和前27个优势属。这些结果表明肺癌、慢阻肺和社区获得性肺炎患者的肺部微生物群组成存在多样性。不同培养条件下每个样本分离出的细菌种类数列于表S1。
同时，我们评估了在不同培养条件下，从三组样本中分离出的细菌在门水平上的分布。通过直接接种培养（二氧化碳培养和微需氧培养）从三组BALF样本中分离出的细菌总数高于预孵育培养（需氧瓶和厌氧瓶）。在三组中，肺癌组和慢阻肺组在微需氧培养条件下分离出的细菌种类多样性最高，分别有67种和53种。相比之下，社区获得性肺炎组在二氧化碳培养条件下分离出的细菌种类数量最多，总计58种。所有三组中的优势门均为Bacillota，其次是Pseudomonadota和Actinomycetota。值得注意的是，在肺癌组和慢阻肺组中，Fusobacteriota门的物种仅在微需氧培养条件下分离，而在社区获得性肺炎组中，它们可以从二氧化碳培养和微需氧培养环境中分离。在三组的所有四种培养条件下分离出的细菌种类数量分别为16、14和13。然而，仍有大量细菌仅在特定培养条件下被分离。这表明结合多种培养条件可以实现细菌的有效分离和培养。此外，还分析了个体细菌在三组中的分离频率。图S1C展示了每组中分离频率最高的前20种细菌。缓症链球菌（78.57%）在肺癌组中表现出最高的分离频率，副血链球菌（68.75%）在慢阻肺组中，龋齿放线菌（82.50%）在社区获得性肺炎组中。此外，我们分离出五株细菌，虽然之前从环境来源中已获得，但这是首次从临床患者中分离。
通过16S rRNA基因测序分析的肺部微生物组谱
对于16S rRNA基因测序，从48个样本（包括18个肺癌样本，16个慢阻肺样本和14个社区获得性肺炎样本）中生成了总共3,726,398条原始读数。对这些读数进行处理后，得到3,713,184条高质量读数（肺癌组1,599,354条，慢阻肺组1,218,410条，社区获得性肺炎组895,420条），平均每个样本77,358条读数。此外，肺部微生物群分析揭示了3,780个操作分类单元(OTU)的存在，平均覆盖度为99.87%，表明对肺部细菌群落进行了全面检测。根据图2A所示的维恩图，三组间共享986个OTU，而肺癌、慢阻肺和社区获得性肺炎患者分别有474、255和1,170个独有OTU。细菌OTU被分类为28个门、63个纲、155个目、272个科、560个属和676个种。在门水平上，三组的主要成分为Bacillota（肺癌31.8%；慢阻肺35.3%；社区获得性肺炎45.4%）、Bacteroidota（肺癌27.2%；慢阻肺23.0%；社区获得性肺炎25.8%）和Pseudomonadota（肺癌26.3%；慢阻肺21.0%；社区获得性肺炎14.7%），三者合计占检测到的门的79.4%–85.8%。在慢阻肺和肺癌组中，Actinomycetota（13.0%和6.6%）是第四丰富的门，而在社区获得性肺炎组中，Fusobacteriota（3.1%）占据此位置。在属水平上，观察到三组微生物群落组成存在显著差异。具体而言，肺癌组的前10个属是链球菌属、普雷沃菌属7、嗜血杆菌属、异普雷沃菌属、假单胞菌属、韦荣球菌属、普雷沃菌属、卟啉单胞菌属、莫拉菌属和奈瑟菌属。慢阻肺组的前10个属包括链球菌属、卟啉单胞菌属、普雷沃菌属7、韦荣球菌属、土芽孢杆菌属、假单胞菌属、棒状杆菌属、罗氏菌属、嗜血杆菌属和志贺氏杆菌-大肠杆菌属。社区获得性肺炎组的前10个属展示了支原体属、普雷沃菌属7、链球菌属、韦荣球菌属、普雷沃菌属、颗粒链菌属、异普雷沃菌属、放线杆菌属、卟啉单胞菌属和梭杆菌属。值得注意的是，链球菌属、普雷沃菌属7、韦荣球菌属和卟啉单胞菌属均出现在每组的前10位。
肺癌、慢阻肺和社区获得性肺炎患者肺部微生物群的生物多样性
利用Shannon指数和Chao1指数来评估三组中微生物的丰度和多样性。三组间的Shannon指数没有显著差异。然而，图3B显示，与其他两组相比，社区获得性肺炎组的Chao1指数值显著更高。稀释数据的结果完全证实了我们的原始发现。通过使用Bray–Curtis和加权Unifrac距离生成主坐标分析(PCoA)图进行了细菌β多样性分析，用于评估三组间肺部微生物群的整体差异。结果表明三组之间存在显著差异（Bray–Curtis: R = 0.2862, P = 0.001; 加权Unifrac: R = 0.3222, P = 0.012）。综上所述，我们的研究结果表明肺癌、慢阻肺和社区获得性肺炎组肺部微生物群的细菌α和β多样性存在差异。
肺癌、慢阻肺和社区获得性肺炎组BALF样本中不同分类群和关键致病菌的综合分析
为了研究肺部疾病组BALF中的微生物组成，采用了LEfSe和随机森林模型。首先，使用LEfSe来识别三组间丰度不同的分类群。得到的线性判别分析(LDA)得分直方图和进化分支图揭示了不同分类学水平上的29个不同分类群。值得注意的是，在属水平上，异普雷沃菌属、乏养菌属和支原体属分别被确定为肺癌、慢阻肺和社区获得性肺炎组的指示性分类群。此外，我们对肺部微生物群进行了物种水平分析，这为区分三组之间的显著微生物群提供了有价值的见解。除了用LEfSe识别特定分类群外，我们还进行了随机森林分析，以筛选区分三组样本的关键致病菌。该模型揭示了细菌组成的重要见解，密螺旋体属、支原体属、坦纳菌属、水杆菌属和罗氏菌属表现出较高的准确度分数。为了评估随机森林模型的预测能力，我们绘制了ROC曲线并计算了曲线下面积(AUC)值。我们的研究结果表明，密螺旋体属、口腔杆菌属和异普雷沃菌属在区分肺癌和慢阻肺组方面表现出优异的特异性和敏感性。对于肺癌和社区获得性肺炎组的区分，坦纳菌属被确定为最佳预测属，其次是气球菌属和密螺旋体属。在区分慢阻肺和社区获得性肺炎时，柠檬酸杆菌属成为最优属，其次是肠球菌属和皮肤杆菌属。
对不同临床病理特征的肺癌患者肺部微生物组的深入分析
对于肺癌患者，我们根据其病理诊断和远处转移状态，进一步将其分为腺癌(ADC)和鳞状细胞癌(SCC)组，以及转移和非转移组。我们进行了16S rRNA测序分析来研究肺部微生物组。通过比较腺癌和鳞癌组在属水平上的细菌相对丰度，我们观察到链球菌属是腺癌组的优势属，其次是普雷沃菌属7和异普雷沃菌属。相比之下，鳞癌组表现出最高的假单胞菌属相对丰度，而链球菌属和异普雷沃菌属分别位居第二和第三。对于细菌α多样性分析，Shannon指数和Chao1指数显示两组间的多样性相似。使用Bray-Curtis距离评估的β多样性也显示两组间无显著差异。随后，我们进行了LEfSe分析，以识别区分两组间的微生物生物标志物。结果表明，黑色素普雷沃菌7、副流感嗜血杆菌和流感嗜血杆菌可能作为腺癌和鳞癌组的潜在生物标志物。AUC被用来衡量LEfSe识别的三个物种的预测准确性。我们的研究结果表明，黑色素普雷沃菌7和副流感嗜血杆菌具有更高的AUC值。先前的研究表明肺部微生物组与肺癌远处转移的发展存在关联。因此，使用相同的方法评估了转移组和非转移组之间的微生物组成差异。在属水平上的丰度分析显示，两组中排名前两位的属都是链球菌属和普雷沃菌属7。转移组中第三丰富的属是嗜血杆菌属，而在非转移组中则是异普雷沃菌属。使用Shannon指数、Chao1指数和Bray-Curtis距离进行的多样性分析结果表明，两组之间的α和β多样性无统计学显著差异。结论是，在诊断为肺癌的个体中，肺部微生物组的多样性与远处转移的存在之间没有关联。进行了LEfSe分析以彻底评估转移组和非转移组之间的差异。我们观察到两组间在11个不同分类群上存在丰度的显著差异。其中，4个分类群在物种水平上显示出差异丰度，强调了它们在区分两组中的重要性。在转移组中检测到孪生厌氧球菌和不可见戴阿利斯特杆菌的丰度更高，而在非转移组中发现Prevotella nanceiensis和牙龈二氧化碳嗜纤维菌的丰度更高。根据ROC分析，不可见戴阿利斯特杆菌在区分肺癌转移和非转移患者方面表现出中等的诊断价值，而牙龈二氧化碳嗜纤维菌没有显示出统计学意义。
讨论
以往的研究已经证实，肺部微生物群落的改变与多种肺部疾病的进展密切相关。这突显了它们通过影响宿主炎症、免疫反应和代谢途径，在这些疾病的发病机制和发展中发挥的关键作用。在本研究中，我们利用培养组学和16S rRNA测序技术探索和分析了肺癌、慢阻肺和社区获得性肺炎患者的肺部微生物组，揭示了它们肺部微生物群的显著差异。
通过应用培养组学，可以在物种水平上鉴定细菌，极大地丰富了人类可培养细菌数据库。报告显示，从人类体内分离和培养的细菌种类数量从2018年的2776种增加到2020年的3253种，其中大多数物种是通过培养组学鉴定的。一些研究调查了肺部微生物群，发现在门水平上主要由Bacillota、Actinomycetota、Pseudomonadota、Bacteroidota和Fusobacteriota组成，这与我们的发现一致。培养组学的一个优势是能够分离活的细菌，为后续菌株研究提供了条件。我们已经通过培养组学鉴定出五株首次从人体分离的细菌菌株，对其毒力和致病性的进一步研究将产生重要见解。众所周知，某些细菌只能在微需氧条件下培养；然而，培养组学领域的研究人员很少考虑微需氧条件。通过引入微需氧培养条件，我们的研究显示肺癌、慢阻肺和社区获得性肺炎组可培养细菌的数量分别显著增加了14.1%、12.4%和9.7%。这强调了利用微需氧条件来增加可培养细菌种类多样性的必要性，可作为该领域未来研究的重要参考。
我们通过培养组学方法获得的一个显著发现是，在所有患者组中，口腔共生细菌（如缓症链球菌和龋齿放线菌）的分离频率都很高。这一观察结果与肺部生物地理学的“适应岛屿模型”概念一致，即肺部微生物组不断通过上呼吸道的微吸入而获得种子，但随后由局部宿主条件塑造而成。这些类群的普遍存在可以以几种方式解释：作为潜在的操作污染证据，作为正常气道消化道沟通的证据，或作为病理性菌群失调的迹象。虽然我们采用了严格的支气管镜采样和口腔卫生方案以尽量减少污染，但我们不能完全排除其影响。我们认为，在患病肺部，受损的粘膜免疫和纤毛清除功能破坏了平衡，使得口腔来源的细菌富集和持续存在。这种“特异性丧失”和共生菌的扩增可能是受损肺部微环境的一个特征，可能有助于慢性炎症和疾病进展，而不仅仅是解剖结构的被动反映。
我们观察到三组间的Chao1指数存在显著差异。相比之下，Shannon指数没有差异。值得注意的是，社区获得性肺炎组不仅表现出更高的微生物群丰富度，而且微生物组成也表现出最大的异质性。这表明社区获得性肺炎的肺部微环境可能支持更广泛的微生物群落，这可能是由于该综合征具有多样的病因学和高度可变的宿主免疫反应。这种固有的病因学异质性很可能解释了我们观察到的分散模式，表明没有单一的“社区获得性肺炎微生物组”，而是与该综合征相关的一系列微生物状态。这一见解强调了社区获得性肺炎的复杂性，并突出了肺部微生物组揭示该患者群体内亚表型的潜力，这可能对未来个性化治疗策略产生影响。然而，对此问题的看法不一。一些
