《Microbiology Spectrum》：Absence of detectable bovine leukemia virus miRNAs in human cancer small RNA-seq datasets
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本研究通过一项覆盖335个公共人类小RNA测序数据集的超高灵敏度筛查，旨在探寻牛白血病病毒（BLV）编码的微小RNA（miRNA）是否存在于人类癌症（特别是乳腺癌BCA和多种白血病）中。研究分析了近二十亿条（~1.98 billion）经质控的测序序列，结果仅发现极少量可能与背景噪音一致的比对片段，而在阳性对照（感染BLV的牛样本）中却能稳健检出BLV miRNA。该研究有力地表明，在标准小RNA测序流程下，BLV miRNAs在特定人类癌症（白血病与BCA）的miRNA组中不存在或低于可检测水平，这为澄清BLV与人类癌症关联的争议性假说提供了重要的实证数据。
正文内容
导论
牛白血病病毒是一种德尔塔逆转录病毒，可导致高达10%的受感染牛发生恶性B细胞淋巴瘤。关于BLV与人类癌症（特别是乳腺癌）发展之间的关联，科学界存在争议。一方面，有病例对照研究报告，在人类乳腺组织中通过原位PCR检测到BLV前病毒DNA的存在，与罹患乳腺癌的风险增加相关。此外，在人类血浆中也检测到了BLV反应性抗体，尽管其潜在感染途径尚不清楚。另一方面，一些大型研究，包括对来自癌症基因组图谱的乳腺癌样本进行的全基因组和全转录组测序分析，未能检测到与BLV前病毒DNA或病毒转录本相对应的测序读数。这些相互矛盾的结果促使研究者探索其他可能的病毒因素，例如BLV衍生的微小RNA，它们可能参与致癌过程。
微小RNA是一类长度通常为19-24个核苷酸的小RNA分子，它们通过与信使RNA序列互补结合，导致靶mRNA降解或翻译抑制。众所周知，miRNA在多种人类癌症类型中持续失调，影响关键的生物学通路，最终导致肿瘤进展。近期研究发现，BLV编码的miRNA与致癌通路中不同基因的调控有关。例如，其中一个BLV miRNA（blv-miR-b4-3p）的种子区域序列与人类miR-29a共享9个核苷酸。miR-29a是一种被充分描述的原癌miRNA，可靶向HMG-box转录因子1和过氧化物酶同源物mRNA，降低其表达。这两种蛋白产物在B细胞中均具有抗肿瘤活性。内源性miR-29a的过表达与人类B细胞恶性肿瘤相关。体外和体内研究表明，blv-miR-b4-3p可下调HBP-1和PXDN的表达。鉴于miR-29a的致癌作用，blv-miR-b4-3p可能参与了BLV相关的肿瘤发生机制。
此外，已知miRNA可以通过存在于人和牛乳汁与初乳中的脂质细胞外囊泡进行传递。这些miRNA能抵抗巴氏杀菌等工业加工过程。含有miRNA的EV在胃肠道中稳定存在，有利于其被摄入个体吸收并随后转移至血液循环。体外研究还证明，人类细胞能够吸收来自牛源囊泡的外源miRNA，且BLV miRNAs可以与人类肿瘤过程相关基因相互作用。基于这些观察，本研究旨在通过实证检测人类癌症（如乳腺癌、白血病和淋巴瘤）中是否存在BLV miRNAs。本研究的目的并非验证因果关系，而是通过一项跨多个数据集的高灵敏度筛查，评估人类癌症miRNA组中是否存在任何可检测的BLV miRNA信号。
材料与方法
本研究总共分析了来自九个不同小RNA测序开放研究的335个人类miRNA组，样本来自癌症患者（乳腺癌、急性淋巴细胞白血病、急性髓系白血病、慢性淋巴细胞白血病）和健康对照者。为了验证分析流程的检测灵敏度，我们还分析了六个先前已表征过BLV miRNA表达的牛数据集。
所有数据分析均使用Galaxy平台进行。从NCBI获取原始fastq文件，使用FastQC进行原始测序数据质量评估。使用CutAdapt和/或Trim Galore对接头和低质量末端进行修剪，并移除长度小于18 bp或大于30 bp的序列。随后，将fastq文件解析为fasta格式，丢弃含有非典型核苷酸的序列，并使用miRDeep2映射工具对相同的读段进行合并。
在进行序列比对之前，从miRbase下载所有BLV miRNA、对照miRNA及其发夹前体的参考序列，并上传至Galaxy服务器。我们使用miRDeep2 quantifier工具在人类癌症样本中搜索BLV miRNAs，旨在以最大灵敏度检测和定量已知的BLV miRNAs。分析使用合并后的小RNA测序读段以及成熟和 precursor 的BLV编码miRNA作为输入。miRNA定量过程包括先将读段映射到miRNA前体序列，再映射到相应的成熟miRNA。为了提高灵敏度，允许最多两个错配。为了避免丢失弱信号，本研究未进行标准化处理，因为研究目的不是评估差异表达，而是检测BLV miRNAs的存在。此外，一组人类miRNA（hsa-mir-29a-3p、hsa-miR-106b-5p和hsa-miR-21-5p）被用作数据完整性的阳性对照。
结果与分析
在分析涵盖的335个人类miRNA组数据集中，总共只有60条读段与BLV miRNA参考序列比对成功，这仅占约19.8亿条经修剪总读段的0.000003%。这些比对上的读段绝大多数是非典型的链或包含错配的序列，这种模式与背景噪音一致，而非具有生物学意义的病毒miRNA信号。相比之下，在阳性对照的BLV感染牛样本中，BLV miRNAs被稳健地检测到，这证实了分析流程对典型BLV miRNAs具有较高的灵敏度。研究结果总结在多个详细的表格中，分别对应不同的测序项目。
具体而言，在乳腺癌筛查人群的外泌体小RNA测序数据集中，无论是健康对照样本还是乳腺癌样本，几乎所有BLV miRNA的比对计数均为零，仅偶有零星、孤立的计数，且与阳性对照人类miRNA（如hsa-miR-21-5p、hsa-mir-29a-3p）的高丰度表达形成鲜明对比。在埃及人群的儿童急性髓系白血病miRNA分析项目中，同样未在任何样本中检测到有意义的BLV miRNA信号。在涉及急性髓系白血病完全缓解期和初诊期的样本中，BLV miRNAs也基本缺失。在慢性淋巴细胞白血病样本中，仅在一个样本中检测到2条比对到blv-miR-B1-5p的读段，这极有可能是噪音。在巴西儿童急性淋巴细胞白血病研究中，也仅在极少数样本中检测到个位数的疑似比对，且不具有一致性。在另外两组乳腺癌与正常组织的对比研究中，BLV miRNAs的比对计数几乎全部为零，阳性人类miRNA则表现出显著的表达水平。在涉及高风险良性乳腺肿瘤、早期乳腺癌和低风险良性病变的研究中，同样未能检测到显著的BLV miRNA信号。
综合所有数据集的结果，一个明确的结论是：在标准的小RNA测序工作流程和使用典型参考序列的条件下，BLV miRNAs在人类乳腺癌和人类白血病miRNA组中不存在，或者低于实际操作检测阈值。所观察到的极少数比对很可能是测序或数据分析过程中产生的随机背景噪音。
重要性
牛白血病病毒会导致牛的白血病。其基因组编码的微小RNA可以影响细胞生长。一些研究者提出，BLV可能也在人类癌症，特别是乳腺癌中扮演角色，但各项科学研究结果相互矛盾。在我们的工作中，我们分析了来自335个人类癌症样本（包括乳腺癌和几种类型的白血病）的近二十亿条遗传序列，以寻找BLV miRNAs。我们几乎找不到任何类似于BLV miRNAs的序列，那些极少数的可能代表了背景噪音而非真实的病毒信号。相比之下，在受感染的牛样本中，BLV miRNAs能够被轻易检测到。我们的结果表明，BLV miRNAs在特定的人类癌症（即白血病和乳腺癌）中不存在于有意义的水平。
