《Fishes》：Functional Feed Additives Promote Recovery from Runting and Stunting Syndrome in Apostichopus japonicus: Links Between Growth Traits, Digestive Function, and the Gut Microbiome
Xinyue Hu,
Chongyang Wang,
Anqi Wang and
Guangyu Wang
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本研究聚焦于仿刺参（Apostichopus japonicus）养殖中常见的生长迟缓综合征（RSS），通过在日粮中分别添加海洋泥、有效微生物（EM）、酵母、海带粉和发酵海带粉等营养性添加剂，探究其对RSS幼参恢复效果、消化酶活性及肠道菌群的影响。结果表明，EM和发酵海带粉组恢复率最高，且恢复与肠道蛋白酶、褐藻酸裂解酶和纤维素酶活性升高、异养细菌数量增加以及弧菌（Vibrio）相对丰度降低密切相关。高通量测序进一步揭示了添加剂处理如何重塑肠道菌群结构，其中较低的弧菌丰度与较好的恢复结果相关联。这为通过调控肠道微生物和靶向抑制潜在病原体来治疗RSS提供了新见解。
1. 引言
全球水产养殖业的快速扩张导致养殖环境不断恶化，而市场对高价值海产品仿刺参的需求持续增长，这使其供应面临挑战。在仿刺参大规模养殖中，生长迟缓综合征（RSS）在苗种培育阶段频繁发生，其特征包括体表皱缩、体壁颜色加深、疣足短而粗、生长迟缓以及摄食和活动能力下降。RSS的发生与高密度养殖、种质质量、种内竞争、环境胁迫和营养失衡等多种因素有关。与鸡和仔猪等经济动物的类似生长迟缓综合征相比，对仿刺参RSS的系统研究仍不足，且缺乏明确的恢复策略。相较于旨在提高免疫功能的药物干预，在饲料中添加功能性成分具有成本效益高、环境友好和二次副作用风险低等优势，已成为国际水产养殖的主流策略。海洋泥、微生物（益生菌）制剂和大型藻类等常用作仿刺参的饲料添加剂。基于所测试添加剂的功能特性，预期不同的营养添加剂会对仿刺参RSS产生不同的恢复促进作用。本研究模拟高密度养殖环境，诱导仿刺参产生RSS，并以发育不良的RSS个体为研究对象，在基础饲料中梯度添加海洋泥、有效微生物（EM）、酵母、海带粉和发酵海带粉，旨在评估RSS仿刺参在生长性能、肠道菌群动态、消化酶活性和相关生理参数方面的变化，并通过高通量测序表征肠道菌群在门和属水平上的演替模式，为RSS的恢复提供理论基础和技术途径。
2. 材料与方法
2.1. 实验动物
实验所用仿刺参幼体由威海无棣岛水产有限公司提供。在实验室条件下，通过高养殖密度（5.50 kg m-3）和低换水率（每日更换10%新鲜海水）的饲养胁迫诱导35天，使其产生RSS表型。诱导后，选择表现出典型RSS特征的个体作为饮食恢复实验的研究对象。
2.2. 饲喂日粮
实验所用基础饲料和海洋泥购自威海金派生物技术有限公司。EM制剂和酵母在实验室培养。海带粉由荣成开普生物工程有限公司提供。发酵海带粉的制备则使用了本实验室保藏的高产褐藻酸裂解酶菌株HSJ-04。所有营养添加剂与基础饲料在28°C下按指定比例混合8小时后投喂。
2.3. 实验设计与饲喂策略
实验在玻璃养殖缸中进行。将诱导产生的RSS幼参随机分配到饮食补充组和对照组。各组的饮食补充方案汇总于表中。所有补充组的养殖密度均维持在约5.50 kg m-3。在对照组（CON）中，仅提供基础饲料和海洋泥；海洋泥组（MM）添加了10倍于基础饲料的海洋泥；EM组（EM）和酵母组（Y）分别添加了2倍（w/v）于基础饲料的EM制剂和酵母；海带粉组（K）和发酵海带粉组（FK）则用海带粉或发酵海带粉替代了50%（干重基础）的基础饲料。实验持续35天，每天投喂一次。期间，每个养殖缸每日更换30%的新鲜海水，每7天进行一次100%的彻底换水。海水温度维持在14.00 ± 1.00 °C，持续充气，溶解氧保持在5.00 mg L-1以上。
2.4. 分析方法
2.4.1. 组织学观察与H&E染色
记录仿刺参的外部形态，并收集肠道组织进行苏木精-伊红（H&E）染色，比较各组间的肠道横截面结构。
2.4.2. 生长性能测定
实验期间，每7天检查一次仿刺参的外部形态，记录表现出RSS的个体数量以计算RSS形成率。收集并称量每组所有个体以计算特定生长率（SGR）。在每次采样时，从每组随机选取三个RSS个体进行解剖，测量体重、体壁重和肠道重，以计算体壁出成率（BWY）和肠体壁比（IBR）。使用文中给出的公式计算恢复率（RRi）、BWY、IBR和SGR。
2.4.3. 肠道消化酶活性测定
在每个采样时间点，从每个重复缸中随机选取三个个体进行肠道组织取样。组织在冰上匀浆，提取粗酶液。使用分光光度计测定消化酶活性。蛋白酶活性采用福林-酚试剂法测定，以0.5%酪蛋白为底物。纤维素酶和褐藻酸裂解酶活性采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定，分别以0.5%羧甲基纤维素钠和0.5%海藻酸钠为底物。酶活性单位定义为在测定条件下，每克肠道组织每分钟释放1微克酪氨酸（蛋白酶）或产生相当于1微克葡萄糖的还原糖（纤维素酶/褐藻酸裂解酶）所需的酶量，表达为U g-1肠道组织。
2.4.4. 异养细菌计数
在每个采样时间点，收集肠道内容物，用无菌生理盐水系列稀释后，涂布于2216E琼脂平板上，在20°C下培养5天后计数菌落形成单位（CFU），结果表示为每克肠道内容物的CFU对数（log10CFU g-1）。
2.4.5. 肠道微生物群落的高通量测序
在实验开始（第0天）和结束时（第35天），从每组随机选取三个个体，收集其肠道内容物，提取总DNA。使用通用引物扩增细菌16S rRNA基因的V3-V4高变区，并在Illumina NovaSeq平台进行测序。使用QIIME2和R软件进行数据分析，包括操作分类单元聚类、Alpha多样性（如Chao1、Shannon指数）和Beta多样性（如主坐标分析PCoA）分析，以及在门和属水平上的群落组成分析。
2.4.6. 统计分析
使用SPSS软件进行单因素方差分析，比较组间差异，并用Duncan's多重比较检验进行事后检验。数据以平均值±标准差表示，显著性水平设为p < 0.05。
3. 结果
3.1. RSS诱导与恢复过程中的形态学和组织学变化
通过高密度和低换水胁迫，成功诱导出具有典型RSS表型的仿刺参。恢复实验期间，不同添加剂处理组的RSS个体外部形态恢复情况不同。组织学H&E染色显示，恢复良好的个体肠道结构更完整。
3.2. 生长性能
在整个恢复期，各处理组的RSS恢复率存在差异。恢复率从高到低依次为：EM组（90.91 ± 1.15%）、发酵海带粉组（90.91 ± 4.96%）、酵母组（81.82 ± 5.99%）、海带粉组（72.73 ± 1.35%）、海洋泥组（63.64 ± 1.41%）和对照组（54.55 ± 1.47%）。EM组和发酵海带粉组表现出最高的恢复率。在特定生长率、体壁出成率和肠体壁比等指标上，EM组和发酵海带粉组也普遍优于其他组。
3.3. 肠道消化酶活性
恢复期间，各处理组肠道蛋白酶、褐藻酸裂解酶和纤维素酶活性均呈现动态变化。总体而言，EM组和发酵海带粉组的三种消化酶活性在实验后期均显著高于对照组和其他处理组。消化酶活性的升高与生长性能的改善趋势一致。
3.4. 肠道异养细菌总数
肠道异养细菌总数在恢复期间发生变化。在实验后期，EM组和发酵海带粉组的异养细菌总数显著高于对照组。异养细菌数量的增加可能反映了肠道微生物活性的增强。
3.5. 肠道菌群结构
高通量测序结果表明，营养添加剂处理影响了RSS仿刺参的肠道微生物群落结构。在门水平上，芽孢杆菌门（Bacillota）（26.45–48.08%）、放线菌门（Actinomycetota）（13.96–44.99%）和假单胞菌门（Pseudomonadota）（9.15–56.46%）是肠道中的优势菌门。在属水平上，较低的弧菌（Vibrio）相对丰度与改善的恢复相关，弧菌水平较低的组通常表现出更好的恢复结果；值得注意的是，EM组显示出最低的弧菌相对丰度（1.37%）。Alpha多样性分析显示，不同处理组间的微生物丰富度和均匀度存在差异。Beta多样性分析（PCoA）表明，不同添加剂处理对肠道菌群结构产生了显著影响。
4. 讨论
本研究表明，在饲料中添加功能性营养添加剂能有效促进仿刺参RSS的恢复，其中以复合微生物制剂EM和经过发酵处理的海带粉效果最为显著。其促进恢复的机制可能与以下几个方面有关：首先，添加剂处理提高了肠道消化酶（蛋白酶、褐藻酸裂解酶、纤维素酶）的活性，从而增强了仿刺参对饲料中蛋白质和多糖等营养物质的消化吸收能力，为生长恢复提供了物质基础。其次，添加剂处理改变了肠道菌群结构，增加了有益或共生菌的数量（如反映在异养细菌总数增加），并显著降低了潜在病原菌弧菌的相对丰度。肠道菌群结构的这种有益转变可能通过支持潜在的能量供应、免疫调节和功能恢复来促进宿主健康。研究结果强调了肠道消化功能和微生物区系在RSS发生与恢复中的关键作用。通过营养策略调控肠道菌群，靶向抑制潜在病原体（如弧菌），并富集有益微生物，是预防和治疗仿刺参RSS的有效途径。这为开发基于有益微生物和特定饲料添加剂的RSS防控策略提供了新的见解和理论依据。
5. 结论
综上所述，在饲料中添加功能性营养添加剂，特别是有效微生物（EM）和发酵海带粉，能够有效促进仿刺参生长迟缓综合征（RSS）的恢复。其作用机制涉及提高肠道消化酶活性、增加异养细菌数量以及重塑肠道微生物群落结构，尤其是降低潜在致病菌弧菌的相对丰度。这些发现为通过饲料添加剂调控肠道微生态来治疗水产动物生长障碍提供了新的思路和实用技术参考。
