膳食大豆异黄酮促进雌性日本鳗鲡亲鱼卵巢发育的预处理效应研究

《Fishes》：Dietary Soy Isoflavones as a Pretreatment for Enhancing Ovarian Development in Female Japanese Eel (Anguilla japonica) Broodstock Kanghong Jiang, Jingwei Liu, Zhenzhu Wei, Bin Xie, Xiangbiao Zeng, Justice Frimpong Amankwah, Tianwei Jiang, Yanhe Liu, Kang Li and Liping Liu

本研究以雌性日本鳗鲡（Anguilla japonica）亲鱼为研究对象，通过为期4周的饲喂实验，评估了饲料中添加不同水平（0、0.1、0.5、0.9 mg/g）大豆异黄酮对亲鱼生长、卵巢组织学、性激素水平、卵黄蛋白原（VTG）含量及相关基因表达的影响。结果表明，添加0.5-0.9 mg/g大豆异黄酮可显著提高性腺指数（GSI）和卵母细胞横截面积（CSA），促进卵巢发育至早期卵黄发生阶段。其潜在作用机制涉及下调卵巢中雌激素受体（er）和细胞色素P450芳香化酶（cyp19a）基因表达，导致血清雌二醇（E2）下降、睾酮积累，并上调肝脏中卵黄蛋白原（vtg）基因的表达。该研究为大豆异黄酮作为营养预处理策略，增强日本鳗鲡亲鱼早期卵巢发育、优化后续人工繁殖的激素诱导响应提供了科学依据。

　　

1. 引言

日本鳗鲡（Anguilla japonica）是东亚地区极具经济价值的水产养殖物种，但其产业发展面临严峻挑战，因其养殖完全依赖于捕捞野生鳗苗，导致了过度捕捞和野生资源的急剧衰退。尽管在人工养殖中实现其全生活史周期、提高仔稚鱼培育存活率等方面已取得重要里程碑，但稳定获得卵巢发育成熟的优质亲鱼仍是人工繁殖的主要障碍。性腺的成功成熟是人工繁殖的基石，因此开发有效的亲鱼培育方案成为研究重点。

在此背景下，营养强化已成为提高养殖鱼类繁殖性能的关键策略。包括特定营养素、活饵料和植物源性材料在内的多种饲料添加剂已被研究用于促进性腺发育。其中，植物雌激素因其结构与脊椎动物雌激素相似，显示出在水产养殖中的应用潜力。大豆异黄酮是大豆中含量最丰富、研究最广泛的植物雌激素之一，主要以糖苷（如大豆苷、染料木苷）及其苷元（如大豆黄酮、染料木黄酮）形式存在。已有研究表明，大豆异黄酮可促进日本鳗鲡幼鱼的雌性化，并能增强雌性黄颡鱼的繁殖性能。然而，其作用具有高度的物种、性别、发育阶段和剂量依赖性。目前，大豆异黄酮对成年雌性日本鳗鲡亲鱼卵巢发育的影响尚不清楚。本研究旨在填补这一空白，评估其短期饲喂对雌性日本鳗鲡亲鱼生长、卵巢组织形态、性激素、卵黄蛋白原含量及相关关键基因表达的影响，为开发针对性的亲鱼营养策略提供科学依据。

2. 材料与方法

实验选用体重为550 ± 50 g的2龄雌性日本鳗鲡亲鱼，在淡水循环水养殖系统中暂养。将120尾鳗鲡随机分为4组，每组3个重复，分别投喂添加0（对照组，C）、0.1（L）、0.5（M）和0.9（H）mg/g大豆异黄酮的实验饲料，饲喂周期为4周。实验结束后，采集血清、肝脏和卵巢样本。测量生长性能指标，包括性腺指数（GSI）、肝体指数（HSI）和增重率（WG）。通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测血清中雌二醇（E₂）、睾酮（T）和总胆固醇（TC）的含量，以及肝脏和卵巢中卵黄蛋白原（VTG）的含量。对卵巢和肝脏样本进行石蜡切片和HE染色，观察组织学变化，并测量卵母细胞横截面积（CSA）和发育阶段。通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析肝脏中卵黄蛋白原（vtg）、雌激素受体（er）以及卵巢中er、细胞色素P450芳香化酶（cyp19a）的基因表达水平。所有数据使用SPSS和Origin软件进行统计分析。

3. 结果

3.1. 生长性能

在L和M组，鳗鲡的性腺指数（GSI）显著高于对照组，但H组的GSI与对照组相比无显著差异。各组间的初始体重、终末体重、增重率和肝体指数均无显著差异。值得注意的是，M组的增重率有轻微上升。

3.2. 卵巢组织学、卵母细胞横截面积和发育阶段分布

在M和H组，大部分卵母细胞的细胞质被油滴完全充满，核仁变小、数量增多。在卵母细胞横截面积方面，对照组在0-1 × 10⁴像素区域的CSA百分比显著高于其他组。在2 × 10⁴–3 × 10⁴像素区域，各处理组的CSA百分比均高于对照组，且差异显著。在大于3 × 10⁴像素区域，只有M组的CSA百分比显著增加。所有组别鳗鲡的卵巢均处于第II期，卵母细胞发育阶段分为早期油滴期、晚期油滴期和早期卵黄发生期。在对照组和L组，约90%的卵母细胞处于早期和晚期油滴期；而在M和H组，大部分卵母细胞已进入早期卵黄发生阶段。肝脏组织学切片分析显示，各组均未出现明显的病理变化，肝细胞形态正常。

3.3. 性类固醇激素和总胆固醇水平

处理组的血清雌二醇浓度均降低，其中M组水平最低，与对照组相比差异显著，而L和H组与对照组相比无显著差异。各处理组的血清睾酮水平均高于对照组，但仅L和M组与对照组相比差异显著。血清总胆固醇的变化趋势与睾酮相似，各处理组均有所升高，其中L和M组显著高于对照组，H组与对照组无显著差异。观察到剂量依赖性的U型或倒U型曲线。

3.4. 肝脏和卵巢中卵黄蛋白原含量

肝脏和卵巢中的VTG含量在各组间均无显著差异。在卵巢中，M和H组的VTG含量略高于对照组，但无显著差异。

3.5. cyp19a, er和vtg基因表达水平

在肝脏中，仅L组的er基因表达水平显著上调，其他组与对照组相比无显著差异。vtg基因在对照组和L组中未检测到表达，但在M和H组中表达显著上调，且H组的表达量远高于其他组。在卵巢中，与对照组相比，实验组的er和cyp19a基因表达均下调。在M组，er和cyp19a的表达均显著下调；在H组，仅cyp19a的表达显著下调。L组的er和cyp19a表达水平与对照组无显著差异。

4. 讨论

4.1. 大豆异黄酮促进卵巢生长和组织形态学进展

大豆异黄酮有益作用的直接证据来自于关键形态指标和卵巢组织学的显著改善。M和L组的性腺指数显著更高，这为卵巢生长增强提供了初步证据。更重要的是，组织学检查揭示了M和H组卵母细胞发育的实质性进展。观察到的更大卵母细胞横截面积、更多含有卵黄球的卵母细胞、细胞质被油滴完全充满以及核仁增多，表明其营养积累和细胞质生长活跃。卵母细胞阶段分布从对照组和L组的早期和晚期油滴期为主，转变为M和H组大部分卵母细胞进入早期卵黄发生期，标志着成熟过程中的关键一步。这些结果证实，在适当浓度下，大豆异黄酮可有效刺激日本鳗鲡亲鱼卵巢的结构和成分发育。

4.2. 大豆异黄酮调节性激素水平

本研究中总胆固醇浓度随大豆异黄酮剂量增加呈现U型趋势。L和M组总胆固醇水平升高，表明可用于性类固醇合成的底物库增加。本研究中睾酮和雌二醇的逆向关系强烈暗示了雄烯二酮向雌激素转化过程（由芳香化酶催化）的干扰。M组卵巢中er基因和cyp19a基因的显著下调为这种激素转变提供了分子解释。这表明，在测试剂量下，大豆异黄酮在雌性日本鳗鲡亲鱼中可能主要发挥芳香化酶抑制剂的作用。由此导致的睾酮积累——睾酮是早期卵母细胞生长的关键雄激素，也是雌二醇的直接前体——很可能是我们观察到的卵巢发育的关键驱动力。

4.3. 大豆异黄酮诱导卵黄蛋白原基因表达

本研究的一个关键发现是，膳食补充大豆异黄酮可显著诱导肝脏卵黄蛋白原基因表达。M和H组vtgmRNA的显著上调提供了直接的分子证据，表明大豆异黄酮可以在日本鳗鲡肝脏中激活卵黄生成程序。vtg基因的上调凸显了膳食大豆异黄酮启动卵黄生成这一复杂内分泌级联反应的潜力。然而，转录激活并未导致肝脏或卵巢中VTG蛋白含量的增加。这种模式表明，尽管卵黄生成的初始遗传开关被激活，但在当前实验条件下，蛋白质合成和分泌的完整过程并未完成。因此，vtg基因的显著诱导是大豆异黄酮促生殖作用的明确且积极的指标。它证实了这种营养策略有效地调动了肝脏的卵黄生成机制。大豆异黄酮对M和H组性腺发育的促进作用，可能源于其增强卵母细胞对VTG摄取的能力。然而，鉴于日本鳗鲡卵母细胞处于早期卵黄发生阶段，且在该物种中，若无外源性激素刺激，卵黄球的积累有限，其后续发育受到限制。因此，这并未导致VTG产量的显著增加，而仅是其在肝细胞中的含量略有上升。这一结果对未来方案设计具有重要参考价值，表明大豆异黄酮的膳食预处理可用于“启动”肝脏，建立一个分子基础，可能增强后续旨在完成卵黄生成的激素诱导的响应。

4.4. 更广泛的意义与未来展望

本研究未观察到对生长性能和肝脏组织学的负面影响，这强调了此补充方案对日本鳗鲡亲鱼的短期生物安全性，是其潜在整合到现有亲鱼管理方案中的关键实际考量。众所周知，日本鳗鲡无法仅通过营养或环境调控完成性成熟，目前完全依赖于激素诱导来完成最终的卵母细胞成熟和排卵。因此，像本研究提出的营养策略目标，并非替代激素诱导，而是优化激素处理前亲鱼的初始状态。在此背景下，我们的发现具有重要的实际意义。通过将卵母细胞生长和营养积累推进到更高级的发育阶段，大豆异黄酮预处理可能为后续的激素治疗创造更优越的生理起点。拥有更大、更发达卵母细胞的亲鱼，可能对注射的激素产生更同步、更有效的反应，从而潜在地提高卵子质量、受精率和人工繁殖流程的整体效率。

5. 结论

总之，我们的研究表明，在饲料中添加0.5–0.9 mg/g的大豆异黄酮进行为期4周的饲喂，是一种可行且安全的策略，可通过刺激雌性日本鳗鲡亲鱼的早、中期卵巢发育来对其进行预处理。其主要机制涉及对类固醇生成的调节，导致睾酮积累，这可能是通过芳香化酶抑制效应，进而支持卵母细胞生长和营养沉积。vtg基因表达与蛋白质产生之间的解耦联，界定了这种营养策略的边界，证实了其可推进卵子发生，但不能独立启动卵黄生成，这与该物种已知的生殖生理学相符。这项工作巩固了膳食大豆异黄酮的作用——并非替代激素诱导，而是作为一种有前景的预处理工具，用于培育状态更好的日本鳗鲡亲鱼，从而潜在地提高后续人工繁殖程序的成功率。