《Behavioural Brain Research》：Hippocampal energy metabolism reprogramming underlies individual differences in paroxetine-facilitated contextual fear extinction
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个体对帕罗西汀治疗反应的差异与海马区能量代谢重编程相关。本研究通过蛋白质组学和代谢组学分析，发现高反应组在戊糖磷酸途径、嘌呤代谢及三羧酸循环等能量代谢通路存在显著差异，提示能量代谢重编程可能介导SSRI治疗对恐惧消退的不同效果。
范志新|龚霞宇|徐汉芳|王宏伟|陈光福
中国广东省深圳市龙华区妇幼保健院儿科神经康复科
摘要
选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（SSRIs）对不同个体的治疗效果存在显著差异，这仍是治疗焦虑相关障碍面临的主要挑战之一。恐惧消退能力的受损是压力相关心理病理的核心特征。尽管长期使用SSRIs已被证明可以增强恐惧消退，但其导致治疗反应差异的生物学基础仍不明确。
在本研究中，我们通过情境恐惧消退实验，探讨了慢性帕罗西汀治疗引起的大脑海马区分子变化与行为反应差异之间的关系。根据消退保持测试中的冻结行为，将帕罗西汀处理的大鼠分为高反应组和低反应组。基于数据独立获取的蛋白质组学分析发现，高反应组的海马区在突触功能、线粒体过程和代谢调节相关通路中存在明显变化。进一步的靶向代谢物定量分析表明，包括戊糖磷酸途径、嘌呤代谢和三羧酸循环在内的多个能量相关通路与不同的恐惧消退表型相关，并伴有特定代谢物的水平变化。这些结果提示，海马区的适应性能量代谢重编程可能支持慢性帕罗西汀治疗后的不同恐惧消退表型，为理解焦虑相关障碍中的治疗差异提供了机制上的见解。
引言
选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（SSRIs），如帕罗西汀，被认为是治疗抑郁和焦虑障碍（包括广泛性焦虑障碍和创伤后应激障碍（PTSD）的一线药物。尽管它们在减轻症状严重程度和预防PTSD患者复发方面显示出疗效（例如[1]），但治疗反应的个体间差异仍然是一个重大临床问题。只有20-30%的患者能够完全缓解，而大多数患者仅表现出部分反应或无反应[2][3]。理解这种差异的生物学基础对于推进个性化治疗策略至关重要。异常持续的恐惧反应和难以消退的条件反射恐惧是压力和焦虑相关精神障碍的标志性特征[4]。恐惧消退是指在重复暴露于条件刺激（CS）而未出现无条件刺激（US）的情况下，条件反射恐惧反应逐渐减弱的过程，这一过程被广泛用于临床前研究，以探讨情绪调节的神经生物学机制并评估抗焦虑和抗抑郁干预措施的有效性[5]。
长期使用SSRIs已被证明可以促进啮齿动物的恐惧消退[6]。然而，大多数现有研究关注的是SSRIs的群体平均行为效应，从而掩盖了个体间治疗反应的差异。这种依赖于群体水平分析的方法可能掩盖了反应者和非反应者之间的生物学差异，从而限制了这些发现的转化应用价值。虽然已有一些努力试图识别与临床人群中SSRIs反应性相关的外周生物标志物（例如[7][8]），但大脑在SSRIs治疗过程中发生的分子适应性变化仍不清楚。
海马区在情境恐惧学习和消退中起着关键作用，并且特别容易受到压力诱导的神经可塑性变化的影响[9]。然而，介导SSRIs治疗后不同消退结果的分子基础尚未得到充分研究。在本研究中，我们采用数据独立获取（DIA）蛋白质组学方法，分析了对慢性帕罗西汀治疗表现出不同行为反应的大鼠的海马蛋白丰度。在识别和富集差异表达蛋白（DAPs）后，我们将代谢途径作为研究重点。为了进一步验证这些发现，我们使用多反应监测（MRM）技术的LC-MS/MS进行了靶向代谢物定量分析。我们的发现可能有助于深入理解SSRIs在焦虑相关障碍中的分子机制，并为个性化治疗策略的开发提供依据。
实验部分
动物
实验所用成年雄性Wistar大鼠（8周龄，体重180–220克）来自南方医科大学实验动物中心（广州）。大鼠被饲养在温度控制的环境中（23±2°C），遵循12小时光照/黑暗周期，可自由摄取食物和水。经过7天的适应期后，所有行为实验均在光照阶段进行。所有实验方案均获得了深圳Topbiotech机构动物护理委员会的批准。设备
情境恐惧条件反射实验在隔音箱内的条件反射室中进行。实验箱由黑色亚克力材料制成，尺寸为40厘米×40厘米×50厘米。箱底由直径0.3厘米、间距1厘米的不锈钢棒组成，这些钢棒连接到一个电击发生器（JLBehv-FSCR，上海吉良软件技术有限公司，上海）。每次实验后，用70%乙醇清洁实验箱以消除残留气味。预处理
药物给药和分组
帕罗西汀组（n=25）的大鼠每天通过口服给予帕罗西汀（10毫克/千克体重，溶解在纯水中；批号H20031106，华海药业有限公司，浙江）。安慰剂组（n=12）则给予等体积的纯水。药物给药连续进行28天，从第10天到第37天。恐惧消退保持测试后，帕罗西汀组大鼠被分为高反应组（PRX-H）和低反应组（PRX-L）。
组织收集
实验结束后90分钟，大鼠被异氟醚麻醉并处死。迅速取出大脑，在冰上解剖海马区，立即置于液氮中快速冷冻，然后储存在-80°C以待进一步分析。每组随机选取4个生物学重复样本用于蛋白质组和代谢组学分析。
样本制备
蛋白质组学分析基于每组的4个生物学重复样本。海马组织在液氮中冷冻研磨后用SDT缓冲液（436143；Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）进行裂解。裂解液在沸水浴中加热3分钟，然后进行超声破碎2分钟。样品在4°C下以16,000×g离心20分钟，上清液用于BCA蛋白定量（P0012；Beyotime Biotechnology）。
靶向LC-MS/MS定量
每组样本进行4个生物学重复样本的靶向LC-MS/MS定量分析。每个样本准确称取50毫克海马组织。首先将样品与500微升预冷却的80%甲醇-水溶液（体积比1.06007.4008；MilliporeSigma，美国）和两颗不锈钢珠混合，然后在低温下使用组织研磨机进行匀浆。再加入500微升预冷却的80%甲醇-水溶液，随后在冰浴中进行涡旋混合和超声提取。
帕罗西汀治疗后的情境恐惧消退行为差异
在情境恐惧回忆阶段，各组之间的冻结百分比无显著差异（Kruskal-Wallis H(2) = 4.177，p = 0.124；图1B）。在消退训练期间，重复测量方差分析显示时间的主效应显著（F(5.221, 182.728) = 27.477，p < 0.001），而时间×组别的交互作用不显著（F(10.442, 182.728) = 1.445，p = 0.160；图1C）。在消退保持测试中，各组之间存在显著差异。
与帕罗西汀治疗和行为反应差异相关的蛋白质组学变化
基于DIA的蛋白质组学分析每份海马样本鉴定出平均9,662个蛋白质组和73,349个独特肽段，为后续分析提供了足够的蛋白质组深度（补充表S1）。为了便于与先前研究比较，我们还将所有接受帕罗西汀处理的动物作为一个整体与安慰剂对照组进行了蛋白质组学分析。共鉴定出761个差异表达蛋白（DAPs），其中PRX组有707个上调蛋白和54个下调蛋白。
PRX-H组与安慰剂组之间的代谢差异
基于KEGG富集结果的蛋白质组学分析显示，代谢途径是研究重点。为了进一步验证这些发现，我们使用基于MRM的方法对16类代谢物进行了靶向绝对定量分析，包括脂肪酸、核苷、核苷酸及其类似物和磷脂化合物。这些代谢物涵盖了能量代谢、脂质代谢和氨基酸代谢的关键途径。
PRX-H组与PRX-L组之间的代谢差异
PRX-H组和PRX-L组之间有17个代谢物存在显著差异（p < 0.05），其中PRX-H组有8个上调代谢物和9个下调代谢物（补充表S6）。这些代谢物主要为有机酸及其衍生物和磷脂酸（图5A）。富集分析确定了三个显著富集的代谢途径：组氨酸代谢、柠檬酸循环（TCA循环）和β-丙氨酸代谢（图5B）。
关键代谢途径的鉴定
通过整合海马蛋白质组和靶向代谢组学的定量分析，我们发现了两个重叠的代谢途径：戊糖磷酸途径（PPP）和嘌呤代谢（图6A）。在PPP途径中，鉴定出三个差异表达蛋白（Dera、Prps1和Prps2）以及七个显著改变的代谢物：脱氧核糖-5-磷酸、D-核糖-5-磷酸、甘油醛-3-磷酸、果糖-6-磷酸、果糖-1,6-二磷酸、甘油酸等。
讨论
本研究探讨了慢性帕罗西汀治疗大鼠后情境恐惧消退的个体差异的分子基础。通过整合海马蛋白质组和靶向代谢组学分析，我们发现了与高反应性和低反应性相关的不同分子特征。行为学上，帕罗西汀处理的大鼠在情境恐惧消退过程中表现不同。
资助
本研究得到了国家自然科学基金（项目编号82505396）、中国博士后科学基金（项目编号2024M753406）和深圳市儿童健康与疾病临床研究中心（项目编号szcrc2024_016）的支持。
作者贡献声明
陈光福：撰写、审稿与编辑、资金争取。
王宏伟：方法学设计、实验实施。
徐汉芳：方法学设计、实验实施。
龚霞宇：方法学设计、实验实施。
范志新：撰写初稿、数据可视化、方法学设计、实验实施、资金争取、数据分析、概念构建。
利益冲突
作者声明无利益冲突。
