2021年至2024年间，通过病毒宏基因组学技术在肯尼亚沿海地区发现了8个人类副流感病毒的完整基因组序列

《Microbiology Resource Announcements》：Eight coding-complete genomes of human metapneumovirus recovered by virus metagenomics in coastal Kenya, 2021–2024

纳米孔测序在肯尼亚沿海地区获得8个人下呼吸道病毒（hMPV）全基因组，分属A2b/A2.2.1（3株）、A2c-wt/A2.2.2（4株）和B1（1株），填补了非洲地区hMPV基因组数据空白，为分子诊断和全球进化分析提供新数据。

　　

摘要

尽管人类偏肺病毒（hMPV）在优化当地分子诊断和全球系统地理分析方面具有重要意义，但目前来自非洲的完整编码基因组数据仍然非常有限。我们报告了通过纳米孔宏基因组测序从肯尼亚沿海地区（2021-2024年）收集的8个hMPV基因组。这些基因组分别属于A2b/A2.2.1亚系（n = 3个）、A2c-wt/A2.2.2亚系（n = 4个）和B1亚系（n = 1个）。

公告

人类偏肺病毒（hMPV，属于Pneumoviridae科Metapneumovirus属）是一种全球普遍存在的呼吸道病原体，可感染所有年龄段的人群，尤其在婴幼儿和老年人中会引起严重疾病（1）。2024年末中国hMPV病例的激增引发了国际社会的关注，担心这种异常严重的疫情可能会蔓延到其他地区（2）。hMPV基因组是一种负链单链RNA分子（约13.3 kb），包含8个基因（N、P、M、F、M2、SH、G和L）编码的9种蛋白质（3）。根据F基因和/或G基因的系统发育分析，临床分离株可分为两个抗原亚系（A和B），并进一步细分为不同的亚系。具有空间和时间代表性的基因组数据对于更新分子诊断方法、揭示分子适应性以及追踪全球传播路径至关重要（4）。然而，截至2025年12月，GenBank中仅有3.4%（67/1,969个）的基因组（完整性超过90%）和4.4%（148/3,360个）的G基因序列来源于非洲。非洲hMPV基因组数据的匮乏阻碍了对其局部和全球流行病学的全面理解。

我们报告了从2021年至2024年间在肯尼亚Kilifi地区进行的急性呼吸道感染监测研究中收集的8个hMPV基因组（表1）。参与者包括门诊监测、Kilifi县转诊医院的重症肺炎监测以及社区呼吸道感染监测。根据先前的描述（5），通过定量PCR（qPCR）检测Ct值<35.0的样本被鉴定为hMPV阳性，并对其进行了宏基因组测序。病毒RNA使用QIAamp Viral RNA Mini Kit（QIAGEN）提取，然后用TURBO DNase（37°C，30分钟）处理，并用Zymo RNA Clean & Concentrator-5试剂盒纯化。单引物扩增反应使用Sol-A引物（5′-GTTTCCCACTGGAGGATA-N9-3′）进行第一链合成，第二链合成使用Sequenase V2.0互补DNA，随后使用引物（5′-GTTTCCCACTGGAGGATA-3′）和Q5聚合酶进行PCR扩增（30个循环：94°C 15秒，50°C 20秒，68°C 2分钟）。扩增产物用AMPure XP磁珠纯化（×0.6比例），通过Qubit dsDNA HS检测仪进行定量，并使用Native Barcoding V14 Kit制备文库，用于R10.4.1流式细胞仪上的GridION测序及Guppy v6.3.9软件进行自动碱基 calling（https://nanoporetech.com/document/Guppy-protocol）。

表1

表1 样本信息、读取指标以及GenBank和序列读取存档（SRA）的相关链接

样本ID	采集日期	研究	临床状态（Ct）	序列长度	GC含量（%）	总读取次数	hMPV读取次数	亚系	GenBank最接近的条目	一致性（%）	国家，年份	GenBank登录号	SRA登录号
HF001/21	2021年6月9日	HF	S（22.0）	13,292	36.5	1,547,680	101,309	B1	PP947569.1	99.6	美国，2020年	PX120316	SRR35000059
HF002/23	2023年9月18日	HF	S（24.0）	13,321	36.4	949,219	6,277	A2c-wt/A2.2.2	OL794413.1	98.5	荷兰，2010年	PX120317	SRR35000058
HF003/23	2023年10月4日	HF	S（24.3）	13,325	36.3	834,365	26,876	A2c-wt/A2.2.2	OL794413.1	98.5	荷兰，2010年	PX120318	SRR35000057
HS001/23	2023年11月30日	ResViRe	A（24.6）	13,183	36.5	566,197	3,031	A2c-wt/A2.2.2	OL794413.1	98.6	荷兰，2010年	PX120320	SRR35000056
HF004/24	2024年1月9日	HF	S（23.8）	13,305	36.3	652,679	9,716	A2c-wt/A2.2.2	OL794413.1	98.5	荷兰，2010年	PX120319	SRR35000055
IP001/24	2024年11月11日	IP	S（24.0）	13,324	36.0	2,455,055	1,678	A2b/A2.2.1	PV252964.1	99.3	美国，2023年	PX120321	SRR35000054
IP002/24	2024年11月13日	IP	S（26.5）	13,321	36.1	1,271,351	7,587	A2b/A2.2.1	PV252964.1	99.5	美国，2023年	PX120322	SRR35000053
IP003/24	2024年11月18日	IP	S（25.3）	13,322	36.1	758,305	14,296	A2b/A2.2.1	PV252964.1	99.4	美国，2023年	PX120323	SRR35000052

^a

ResViRe是一项基于社区的研究，收集并分析了所有患者的呼吸道样本，不论其症状状态；IP是针对因呼吸道疾病入住Kilifi县医院的婴幼儿的住院肺炎研究；而HF是针对在Kilifi县医疗机构出现呼吸道症状的门诊患者的急性呼吸道疾病研究。

^b

Ct表示qPCR循环阈值；S代表有症状，A代表无症状。

生物信息学分析使用Kraken2（v2.0.8-beta）（6）和预构建的标准16基因组数据库（https://benlangmead.github.io/aws-indexes/k2）从原始读序列中移除了人类读序列；Homo sapiens读序列被排除，接头使用Porechop v0.2.4（7）进行修剪。Contigs使用metaFlye v2.9.6-b1802（8）进行组装。长度大于12 kb且深度大于100×的contigs使用BLASTn（9）与代表性的hMPV亚系参考基因组（登录号：OL794375.1、OL794442.1、OL794455.1、PP591753.1、PV081663.1、PV353978.1、KJ627399.1和NC_039199.1）进行比对，以确定最佳参考序列（一致性超过90%）。每个样本的最佳参考序列用于使用Minimap2 v2.22-r1101（10）进行映射，随后使用Samtools v1.13（11）进行处理，并使用iVar v1.3.1（12）生成共识序列。亚系分配结合了系统发育分析和nextclade（v3.18.1）（https://clades.nextstrain.org/）。除非另有说明，所有工具均使用默认参数运行。

这些基因组的平均长度为13,321 bp（四分位数范围为13,299–13,323 bp），覆盖度超过100×（表1）。基于2025年GenBank序列的亚系特异性系统发育树显示，我们的序列与其他大陆的序列聚类在一起，但A2c-wt/A2.2.2亚系形成了一个主要由非洲序列组成的独立群（图1）。

图1

图1 本研究中生成的8个hMPV基因组的最大似然（ML）亚系特异性系统发育树，这些基因组在全球hMPV基因组（>10 kb）的背景下进行了分析，并从GenBank中检索（截至2025年）。所有树都是在IQ-TREE2 v2.3.5上使用HKY+F+R4核苷酸替换模型重建的（13）。上图显示了基于完整编码基因组的ML树，下图显示了基于G基因序列的ML树。（A和D）B1亚系（n = 324）。（B和E）A2b/A2.2.1亚系（n = 158）。（C和F）A2c-wt/A2.2.2亚系（n = 911）。分支颜色根据采样地点的不同而有所不同。本研究中生成的序列用橙色圆圈标示。

总之，我们提供了来自肯尼亚沿海地区（2021-2024年）的8个完整编码的hMPV序列。这些数据将有助于了解全球hMPV的多样性、分子诊断方法的开发以及系统地理分析。

致谢

作者感谢参与研究的受试者以及KEMRI-Wellcome Trust研究计划中的病原体流行病学和组学小组的成员在样本收集和实验室处理方面的支持。本研究的发表得到了KEMRI主任的许可。

本研究得到了（a）Wellcome（英国）通过职业发展奖（参考编号#226002/A/22/Z和#226002/Z/22/Z）以及（b）国家健康与护理研究所（NIHR；参考编号NIHR156467）的支持，后者利用英国政府的国际发展资金支持全球健康研究。本出版物中表达的观点仅代表作者本人，并不一定代表Wellcome、NIHR或英国政府的立场。A.W.L.得到了撒哈拉以南非洲结核病/HIV研究卓越网络的支持，该网络由Science for Africa基金会（Del-22-007）资助，同时得到了Wellcome Trust和英国外交、联邦与发展办公室的支持，也是欧盟支持的EDCPT2计划的一部分；此外还得到了比尔及梅琳达·盖茨基金会（INV-033558）和Gilead Sciences Inc.（19275）的支持。所有内容均为作者个人观点，不一定反映任何资助方的立场或政策。资助方未参与研究设计、数据收集与分析、发表决定或手稿的编写。对于开放获取，作者已申请了CC-BY公共版权许可。