《Current Research in Toxicology》：An integration of physiological, morphological and biochemical assessments in studying guinea pig models of ototoxicity and otoprotection?a systematic review
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本文系统综述了在豚鼠模型中，整合听觉脑干反应（ABR）、前庭诱发肌源性电位（VEMP）、热量试验等生理学评估，光镜、电镜、共聚焦显微镜等形态学评估，以及Na+，K+-ATP酶、脂质过氧化（LPO）等生物化学评估，构建综合性测试组合，用于探究顺铂、氨基糖苷类药物耳毒性机制及d-蛋氨酸、银杏叶提取物（EGb 761）、水杨酸盐等药物的耳保护作用。该框架为深入理解内耳损伤与防护机制、开发治疗策略提供了详细方案。
探索内耳的警报与护盾：豚鼠模型如何揭示药物耳毒性奥秘
引言
某些治疗药物和化学物质具有损伤内耳系统的能力，导致听力损害和/或前庭功能缺陷，这被称为耳毒性。常见的元凶包括20世纪40年代发现的氨基糖苷类药物、50年代认识的袢利尿剂以及60-70年代开始引人注目的化疗药物。其中，庆大霉素作为氨基糖苷类家族的一员，以其选择性破坏前庭毛细胞的能力而闻名。因此，鼓室内注射庆大霉素已成为治疗梅尼埃病患者顽固性眩晕的首选方法。为对抗耳毒性，多种药物被提议用于耳保护，包括银杏叶提取物、d-蛋氨酸、谷胱甘肽、水杨酸盐等。
当评估一种药物的潜在耳毒性或其对抗已知耳毒性药物的治疗效果时，必须采用整合了生理学、形态学和生物化学评估的综合性测试组合。这种全面的测试组合为研究人员提供了一个详细的框架，以加深对耳毒性驱动机制的理解，并研究实现耳保护的潜在治疗策略。
为何选择豚鼠？
在选择用于听力测量的实验动物时，豚鼠模型通常被认为优于小鼠模型。在豚鼠模型中，可以独立评估每只耳朵的听力水平，而在小鼠模型中则难以实现，因为小鼠的双耳距离太近，难以单独向一只耳朵传递声音刺激。此外，清醒的动物在前庭功能测试中通常不合作，处理大鼠或小鼠有被咬伤的风险。相比之下，豚鼠可以耐受全面的内耳测试组合，包括用于测试听力的听觉脑干反应（ABR）、用于评估半规管功能的热量试验，以及分别用于评估球囊和椭圆囊功能的颈性和眼性前庭诱发肌源性电位（cVEMP和oVEMP）测试。此外，还有用于检查前庭传入神经的电刺激VEMP。然而，关于耳毒性和耳保护的文献中，评估豚鼠前庭功能的研究相对较少，这可能是因为此类测试必须在清醒动物中进行，因为全身麻醉会消除眼球震颤。因此，只有少数报告展示了豚鼠的热量性眼球震颤、cVEMP和oVEMP数据。相比之下，用于评估听力的ABR测试可以在麻醉下进行。
相反，小鼠模型在研究耳蜗耳毒性方面具有独特优势，因为与听力相关的基因已在分子水平上得到广泛表征。因此，小鼠模型更常用于遗传性疾病和衰老的研究，但较少用于前庭毒性的研究。
揭秘耳毒性的“检测工具包”
生理学评估是探测内耳功能的“听诊器”。
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听觉脑干反应（ABR）：在戊巴比妥钠腹腔注射麻醉下，通过点击刺激测定听力阈值。健康豚鼠的双耳阈值约为50 dB SPL。
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双温热量试验：在清醒豚鼠的耳道内灌注冰水，通过眼震电图记录仪记录热量性眼球震颤及其慢相速度。例如，庆大霉素处理的左耳可能出现无反应。o/s) of caloric nystagmus.">
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颈性前庭诱发肌源性电位（cVEMP）测试：在清醒豚鼠单耳给予点击刺激，记录颈部伸肌的肌电反应，用于评估球囊功能。出现双相波（波I和II）表示存在反应。庆大霉素处理的耳朵可能出现cVEMP消失。
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眼性前庭诱发肌源性电位（oVEMP）测试：通过轻敲前额刺激，记录眼下直肌的肌电反应，用于评估椭圆囊功能。出现nI-pI波形表示存在反应。
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电刺激前庭诱发肌源性电位（Galvanic VEMP）测试：在耳后区域施加电刺激，记录颈部肌肉收缩时的电位变化，用于评估前庭传入神经功能。通过减去无颈肌收缩时的反应来消除电伪迹，得到最终的galvanic VEMP波形。
形态学评估如同“显微镜”，直接观察细胞结构的损伤。
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光学显微镜：通过甲苯胺蓝染色，观察如球囊斑等组织的半薄切片。
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电子显微镜：通过超薄切片和铅柠檬酸染色，定量比较耳石器官中I型和II型毛细胞以及支持细胞的密度，计算受损毛细胞的百分比。
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共聚焦显微镜：使用结合了罗丹明的鬼笔环肽探针标记F-肌动蛋白，在耳蜗和前庭全标本上观察毛细胞骨架。
生物化学评估则是探查分子水平的“信号兵”。
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生物化学检测：采集耳蜗外侧壁组织，分析Na+，K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性、脂质过氧化（LPO）水平以及一氧化氮（NO）水平。通过测量ATP水解过程中释放的无机磷酸来评估膜ATP酶活性。通过丙二醛（MDA）的检测来评估LPO。通过化学发光法测量NO水平。
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免疫细胞化学：对含有前庭神经节的脱钙组织块进行切片和处理，使用特定的抗体（如抗-Nav1.8、抗生长相关蛋白-43（GAP-43）、抗P物质（SP）或神经肽Y（NPY））进行孵育和显色，在光学显微镜下观察，以研究神经损伤和再生的生物标志物。
顺铂：抗癌药物的“双刃剑”
铂类药物是含有铂的化疗药物，如顺铂、卡铂和奥沙利铂，它们通过与DNA结合，引起交联，从而诱导肿瘤细胞凋亡来治疗各种癌症。其中，顺铂自1971年以来被认为是一种有效的抗肿瘤剂。其毒性作用是累积性和不可逆的，包括肾毒性、周围神经病变、胃肠道紊乱和耳毒性。
在形态学上，顺铂已被证明会导致豚鼠和人类耳蜗基底转的外毛细胞显著缺失。然而，在前庭分区未发现退行性变化，表明耳蜗分区比前庭分区更容易受到顺铂诱导的耳毒性影响。
由于顺铂诱导耳毒性的发病机制涉及氧化应激，因此采用旨在减少自由基产生的保护策略来防止毛细胞损失并最小化对血管纹的损伤。耳保护剂如d-蛋氨酸已被报道可减轻顺铂耳毒性。
在豚鼠模型中，暴露于顺铂（5 mg/kg/天）7天会导致ABR阈值生理性升高，这与耳蜗基底转毛细胞损失的形态学发现相关。生物化学上，顺铂显著降低耳蜗外侧壁的Na+，K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性，同时促进LPO和NO产生增加，并上调热休克蛋白。
d-蛋氨酸（300 mg/kg/天）对抗顺铂（5 mg/kg/天）耳毒性7天的动物模型中的耳保护作用可能归因于其抗氧化特性、恢复ATP酶活性的能力，以及在共同给药时影响降低顺铂水平。尽管已研究全身给予d-蛋氨酸用于耳保护对抗耳毒性，但其对内耳的有限渗透性引发了关于其保护听力有效性的主要担忧。
施用耳保护剂的途径有两种：全身给药和经鼓室给药。由于全身给药可能会减弱顺铂的抗肿瘤功效，经鼓室给药是一种替代方法，可最大限度地减少全身副作用并避免与顺铂的潜在相互作用。
经鼓室给药的关键步骤是耳保护剂穿过圆窗膜的扩散。这个过程取决于药物的理化性质和圆窗膜的特性。因此，有必要建立有效的局部给药策略，在不影响顺铂抗肿瘤功效的情况下提供耳保护。
最近，纳米颗粒被引入医学的各个领域，因为它们能够将药物递送到特定的靶器官或细胞。大多数研究报告纳米颗粒是安全的，没有显著的细胞活力降低或耳毒性证据。各种纳米技术方法已被用于改善药物药代动力学和治疗效率，包括封装、聚合、表面功能化和控制药物释放。因此，这些策略增强了药物穿过圆窗膜的运输，这正在发展中。
包括含硫醇化合物如d-蛋氨酸、硫辛酸、N-乙酰半胱氨酸和谷胱甘肽在内的抗氧化剂已被测试其清除自由基和保护免受顺铂诱导耳毒性的能力。
有报告称，生理上ABR阈值的升高与顺铂处理豚鼠耳蜗外侧壁中Na+，K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性的生物化学降低相关。有研究利用鼓室内地塞米松给药在豚鼠模型中提供对抗顺铂耳毒性的耳保护。接受腹腔顺铂注射并配合鼓室内地塞米松应用的豚鼠，在8 kHz处的ABR阈值降低。因此，鼓室内给予地塞米松似乎是最大限度地减少顺铂诱导耳毒性的有效策略。
此外，地塞米松已被证明可抑制肿瘤坏死因子-α诱导的小鼠培养成纤维细胞中的细胞因子分泌和炎症反应。因此，在动物模型中结合生理、生化和形态学评估可能有助于评估耳保护剂对抗耳毒性的功效。
在动物模型中整合生理学（ABR阈值比较和前庭反应）、生物化学（酶活性测量）和形态学（毛细胞变性分析）评估可能有助于评估耳保护剂对抗耳毒性的效果。因此，G蛋白偶联受体，如腺苷A受体和大麻素2受体，在动物模型中通过促进ROS清除、抑制ROS生成和减弱炎症反应显示出功效。炎症可能由耳蜗中瞬时受体电位香草酸1（TRPV1）通道的激活引发。此外，顺铂诱导的DNA损伤和随后的凋亡通路激活揭示了预防顺铂诱导耳毒性的潜在治疗靶点。此外，在线粒体靶向抗氧化剂中，MitoQ对抗顺铂诱导耳毒性的保护作用已在动物模型和/或小鼠听觉细胞系中得到评估。
氨基糖苷类：古老的抗生素，内耳的“刺客”
在氨基糖苷类成员中，一些氨基糖苷类药物表现出对耳蜗毒性的倾向，而其他主要影响前庭分区。来自动物模型的研究表明，庆大霉素、妥布霉素的耳毒性潜能相似，约为阿米卡星的4倍。这些氨基糖苷类药物之间耳毒性的差异受几个因素影响，即1）治疗剂量和持续时间，2）药物半衰期，3）肾功能，以及4）给药途径。
耳毒性涉及两个不同的阶段。首先，带正电荷的氨基糖苷类与带负电荷的细胞膜结合。其次，氨基糖苷类进入细胞后细胞内发生的动态变化。有研究比较了豚鼠模型中庆大霉素的摄取和保留，发现局部和全身给药之间的耳蜗变性没有显著差异，可能是因为庆大霉素选择性损伤前庭毛细胞，同时保留耳蜗功能。然而，有报道称接受庆大霉素治疗的患者出现双侧重度感音神经性听力损失，尽管发生率很低（2-3%）。
氨基糖苷类可以螯合铁，形成具有氧化还原活性的铁复合物，促进自由基的产生。有研究提出，水杨酸钠可以通过两种主要机制保护毛细胞免受庆大霉素诱导的耳毒性。首先，水杨酸钠既是铁螯合剂又是自由基清除剂。其次，在氧化应激条件下，水杨酸盐被氧化为2,3-二羟基苯甲酸，这是一种非常有效的铁螯合剂。然而，水杨酸盐既不影响血清庆大霉素水平，也不降低其抗菌功效。
在生理学上，与水杨酸盐联合治疗显著降低了豚鼠模型中庆大霉素诱导的ABR阈值偏移，将严重的听力阈值偏移从超过60 dBSPL降低到小于20 dBSPL。形态学评估证实水杨酸盐对豚鼠的耳蜗毛细胞提供了保护。换句话说，以其铁螯合和抗氧化特性而闻名的水杨酸盐，在豚鼠模型中有效预防了庆大霉素诱导的听力损失。
相比之下，水杨酸钠对顺铂诱导的耳毒性提供了部分耳保护，特别是保护耳蜗的外毛细胞。然而，这种保护是有限的，因为它没有保留这些细胞的功能完整性。
通过圆窗膜局部递送药物已成为治疗人类内耳疾病的有效方法。各种治疗剂，如氨基糖苷类、类固醇、抗氧化剂、生长因子等，被局部应用于豚鼠的圆窗膜，以促进这些药物进入内耳。然而，氨基糖苷类在耳蜗和前庭感觉细胞中表现出不同程度的毒性。因此，在临床使用新药之前，必须在动物模型中进行全面的内耳测试组合，以评估潜在的耳毒性，并确定临床使用的最佳剂量。
此外，线粒体是ROS的主要来源，ROS诱导的氧化应激在耳蜗损伤中起关键作用。在线粒体靶向抗氧化剂中，MitoQ和SkQR1对抗耳毒性的保护作用已在动物模型和/或小鼠听觉细胞系中得到评估。MitoQ或SkQR1都能提供对抗庆大霉素诱导耳毒性的耳保护。然而，尚未在大规模临床试验中进行评估。
氨基糖苷类滴耳剂已被用于治疗耳朵的革兰氏阴性细菌感染；然而，它们的耳毒性引起了重大关注。豚鼠模型通过局部应用庆大霉素、妥布霉素和阿米卡星到圆窗膜上，以比较它们的相对耳毒性。在生理学上，庆大霉素处理的豚鼠中，ABR、热量试验和cVEMP测试的异常率分别为30%、100%和100%。这些发现与前庭分区比耳蜗分区更明显的病理变化相关。
在妥布霉素处理的豚鼠中，ABR、热量试验和cVEMP测试的异常率分别为100%、40%和30%，表明妥布霉素具有选择性耳蜗毒性，对前庭分区的影响较小。在阿米卡星处理的豚鼠中，ABR、热量试验和cVEMP测试的异常率分别为30%、40%和40%，显示其毒性低于庆大霉素。因此，在氨基糖苷类药物组中，庆大霉素
