综合代谢组学、对接技术和动力学分析用于从辣椒（Capsicum annuum L.）中鉴定潜在的α-葡萄糖苷酶抑制性酚类化合物

《Food Bioscience》：Integrated metabolomics, docking, and kinetic analysis to identify potential α-glucosidase inhibitory phenolics from pepper ( Capsicum annuum L.)

本研究通过代谢组学、分子对接和体外酶实验，探究两种非辛辣辣椒品种Meein和Dangjo在不同成熟阶段α-葡萄糖苷酶抑制（AGI）潜力。发现37种代谢物（尤其是酚类）与AGI活性显著相关（P<0.05，VIP>1.5），其中咖啡酸抑制效果最佳（IC50=10.86 μM，优于阿卡波糖）。动力学分析揭示竞争性、非竞争性和混合型抑制机制，分子对接和结构分析验证了结合特异性。结果为开发天然降糖药物提供依据。

　　

Mahvash Afshari|Morteza Sadeghi|Saeed Omrani|Sanghyeob Lee

生物资源工程系，生命科学学院，世宗大学，韩国首尔冠京区Neungdong-ro 209号，邮编05006

摘要

本研究采用整合方法（包括代谢组学、分子对接和体外酶测定），探讨了两种非辛辣型Capsicum annuum品种“Meein”和“Dangjo”中代谢物对α-葡萄糖苷酶（AGI）的抑制潜力。通过对不同成熟阶段果实的UPLC-Orbitrap-MS代谢物分析，发现这些果实的代谢物谱具有差异，并且其AGI活性也各不相同。多元统计分析（包括偏最小二乘回归和皮尔逊相关性分析）确定了37种代谢物（尤其是酚类化合物），这些代谢物与AGI活性显著相关（P < 0.05，VIP > 1.5）；其中一些代谢物此前仅有有限的直接证据表明它们具有抑制α-葡萄糖苷酶的作用。分子对接模拟显示这些代谢物与α-葡萄糖苷酶之间存在较强的结合亲和力，这种亲和力主要源于氢键和范德华相互作用。使用纯代谢物标准进行的体外AGI活性测定进一步证实了这些预测结果，其中咖啡酸的抑制活性最强（IC₅₀ = 10.86 μmol/L），优于参考抑制剂阿卡波糖（IC₅₀ = 17.26 μmol/L）。芥酸和3-羟基丁酸也表现出显著的AGI潜力，两者联合使用时抑制效果更佳（IC₅₀ = 6.98 μmol/L）。Lineweaver–Burk动力学分析揭示了不同的抑制类型：3-羟基丁酸表现为竞争性抑制，3-羟基苯甲酸和4,7-二羟基香豆素表现为非竞争性抑制，而咖啡酸和芥酸则表现为混合型抑制。计算机模拟的二级结构分析进一步证实了配体-酶相互作用的特异性。总体而言，这些发现表明天然存在的C. annuum酚类代谢物具有作为强效α-葡萄糖苷酶抑制剂的潜力，可能成为管理餐后高血糖的天然替代品。

引言

糖尿病是一种慢性碳水化合物代谢紊乱疾病，常伴有严重的微血管并发症，如肾病、神经病变和视网膜病变（Akda?等人，2025年）。2型糖尿病的发病率在工业化国家和发展中国家都在显著增加。2型糖尿病系统并发症的一个关键原因是循环葡萄糖水平持续升高，即高血糖（Efeoglu等人，2025年）。因此，管理2型糖尿病的核心治疗方法是通过抑制碳水化合物水解酶（如α-葡萄糖苷酶）来调节餐后血糖水平，因为α-葡萄糖苷酶催化碳水化合物消化的最终步骤（Ren等人，2018年）。氧化应激在糖尿病并发症的发展中也起着关键作用，这突显了抗氧化化合物在糖尿病管理中的重要性（Ren等人，2018年）。因此，识别和表征具有强自由基清除和抗糖基化活性的天然或合成分子是缓解长期糖尿病并发症的重要研究方向。近期文献广泛研究了这些化合物在改善血糖控制和预防微血管及大血管并发症方面的治疗潜力（?zdemir & Demir，2025年；Sa?lamta?等人，2025年）。其中，辣椒（C. annuum）因其多样的生物活性化合物和潜在的治疗价值而受到越来越多的关注。

辣椒以其特有的辛辣味而闻名，富含酚酸、黄酮类、辣椒素类、类胡萝卜素和必需维生素等植物化学物质（Jang等人，2024年）。多酚是一类具有多种生物活性的化合物，包括抗氧化、降血糖和抗炎作用（Jang等人，2024年）。这些化合物的结构多样性可能解释了它们广泛的生物活性，不同亚类和单个分子对特定分子靶点（包括α-葡萄糖苷酶）的抑制效果各不相同。这些多功能的健康益处突显了辣椒作为功能性食品成分和药物开发中重要生物活性化合物来源的潜力（Jang等人，2024年）。

水果和蔬菜的植物化学成分并非固定不变；在生长和成熟过程中会经历动态变化（Hudáková等人，2023年）。这些成分变化会显著影响其营养价值和功能性以及消费者的喜好（Palma等人，2020年）。因此，了解果实发育过程中各种代谢物的水平和活性变化对于优化收获时间和最大化健康效益至关重要。

近期研究强调了分析单个代谢物与其α-葡萄糖苷酶抑制（AGI）活性关联的价值。例如，对辣椒叶片的代谢组学分析鉴定出21种具有显著AGI潜力的生物活性化合物，主要是黄酮类和羟基肉桂酸衍生物。某些基因型的AG抑制水平高达79%，超过了广泛使用的抗糖尿病药物阿卡波糖（70.8%）（Assefa等人，2021年）。在鉴定出的化合物中，咖啡酰-腐胺的抑制活性最强，半数抑制浓度（IC₅₀）为145 μmol/L，优于阿卡波糖（IC₅₀ = 197 μmol/L）。这一发现突显了某些天然代谢物在糖尿病管理中的治疗潜力（Assefa等人，2021年）。同样，在Tetracera scandens中，基于气相色谱-质谱（GC-MS）的代谢组学分析显示，stigmast-5-ene、stigmasterol和α-tocospiro B的AG结合亲和力高于已知的AGI抑制剂槲皮素（Nokhala等人，2020年）。在Tamarix dioica中，质子核磁共振（¹H NMR）引导的分馏鉴定出tamarixetin、槲皮素和儿茶素等关键AGI活性多酚，对接研究支持了它们的强酶结合潜力（Niaz等人，2021年）。Adenosma bracteosum的乙醇提取物也表现出强烈的AGI活性，其抑制活性归因于isoscutellarein-8-O-β-D-葡萄糖吡喃糖苷，其IC₅₀值比阿卡波糖低十倍（Nguyen等人，2020年）。

分子对接已成为药物发现的一种强大计算方法，是基于结构的药物设计的关键策略（Demir等人，2025a）。该技术广泛用于定量预测小分子（配体）与其目标生物分子（如蛋白质）之间的结合亲和力，并定性揭示它们的相互作用模式和网络（Demir等人，2025b；Stanzione等人，2021年）。这种方法为理解抑制机制和结构-活性关系提供了重要见解，有助于合理选择和优化先导化合物（Bender等人，2021年）。对接模拟还有助于阐明AG-配体相互作用的空间和能量动态，为设计更有效的血糖控制治疗剂奠定基础。

在我们之前的研究中，我们观察到三种辣椒品种（Capsicum annuum Meein（MI）、Dangjo（DJ）和KS）在果实发育不同阶段的总植物化学成分存在显著差异（Afshari等人，2025年）。值得注意的是，AGI活性在成熟早期最高，随着果实成熟而降低。然而，导致这种模式的特定生物活性化合物及其成熟依赖性行为的机制仍不清楚。因此，有必要从测量总植物化学成分转向在果实成熟过程中进行更针对性的代谢物水平分析。尽管人们对辣椒的健康益处越来越认可，但仍然缺乏将代谢物组成变化与功能性AGI活性及潜在分子机制联系起来的综合性研究。填补这一知识空白对于识别具有AGI活性的具体化合物以及优化收获时间以增强生物活性至关重要（Kumari等人，2024年）。

为解决这一空白，本研究旨在系统地识别和量化两种辣椒品种（MI具有高AGI活性，DJ具有低AGI活性）在绿色和红色发育阶段的代谢物谱。我们进一步使用多元统计分析评估了成熟过程中代谢物组成与AGI活性之间的关系。通过分子对接模拟预测了主要代谢物与AG的结合亲和力和相互作用模式，从而揭示了成熟依赖性AGI活性的机制基础。我们通过体外酶测定评估了关键代谢物及其组合的抑制效力，并将结果与参考抑制剂阿卡波糖进行了比较。我们还通过动力学分析和对接验证表征了抑制类型。最后，我们进行了计算机模拟的二级结构分析，以研究配体结合时AG的构象变化，从而揭示其抑制作用的结构基础。

本研究旨在阐明辣椒代谢物如何促进AGI活性，并评估它们作为代谢健康功能性成分的潜力。为此，我们提出了以下假设：（1）具有高AGI活性和低AGI活性的辣椒品种在发育不同阶段表现出不同的代谢物谱；（2）在成熟过程中，AGI活性与代谢物组成的变化显著相关，从而可以识别出最能解释活性差异的代谢物；（3）选定的关键代谢物表现出可测量的α-葡萄糖苷酶抑制作用，并具有明确的抑制机制，这一点得到了酶动力学和基于对接的相互作用分析的支持。这些假设共同构成了将代谢物变化与辣椒中AGI活性联系起来的机制框架。

部分内容

化学品

p-硝基苯基α-D-葡萄糖吡喃糖苷（pNPG，纯度≥99%）和阿卡波糖（纯度≥98%）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。AG购自Abcam（英国剑桥）。所有其他试剂和溶剂均为分析级或高效液相色谱（HPLC）级，以确保实验的准确性和可重复性。亚油酸乙酯、4-羟基-3,5-二甲氧基肉桂酸（芥酸）、3′,4′-二羟基肉桂酸（咖啡酸）、3-羟基苯甲酸等

辣椒果实的成熟和品种依赖性代谢组学特征

LC-MS代谢物谱的PCA分析（图1）概述了辣椒果实中变异的主要来源。前两个主成分（PC1和PC2）分别解释了45.57%和37.50%的总变异，占累积变异的83.07%。PCA得分图根据成熟阶段（绿色 vs. 红色成熟）将样本分为两组，表明成熟是代谢变异的主要来源。

结论

本研究通过结合计算机模拟分子对接和体外酶验证，成功建立了一个综合的AG抑制剂筛选平台，用于识别不同成熟阶段非辛辣型辣椒品种中的生物活性化合物，这些化合物与不同的AGI活性变化相关。代谢组学分析揭示了果实成熟过程中酚类代谢物组成的动态变化。统计分析（包括皮尔逊相关性和PLS分析）

CRediT作者贡献声明

Mahvash Afshari：撰写原始草稿、可视化、方法学设计、实验研究、数据分析。Morteza Sadeghi：撰写原始草稿、数据分析。Saeed Omrani：方法学设计、实验研究。Sanghyeob Lee：撰写、审稿与编辑、项目监督、资源获取、概念构思

数据可用性

数据可应要求提供。

资助

本研究得到了韩国基础科学研究所（国家研究设施和设备中心）的支持，该机构由教育部资助（项目编号：RS-2023-NF001356）；区域创新系统与教育（RISE）通过首尔RISE中心的支持，该中心由教育部和首尔市政府资助（2025-RISE-01-019-04）；以及农业科学和技术发展合作研究计划（RS-2024-00322321）的支持

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。