基于CRISPR/Cas12a的荧光传感器构建及其乳品中阪崎克罗诺杆菌的高灵敏检测应用

　　摘要： 针对食源性致病菌阪崎克罗诺杆菌，构建了一种结合聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）和成簇规律间隔短回文重复序列/相关蛋白12a（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 12a，CRISPR/Cas12a）的荧光检测方法，以实现对阪崎克罗诺杆菌的早期快速检测。首先根据阪崎克罗诺杆菌ompA基因设计并筛选了PCR引物和CRISPR RNA（crRNA）引物，然后使用不同浓度的阪崎克罗诺杆菌基因组测定该方法的灵敏度，使用金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、单核细胞增生李斯特菌基因组进行特异性检验，最后利用所构建的检测方法和qPCR方法分别检测牛奶和婴幼儿配方乳粉中的阪崎克罗诺杆菌以验证方法的准确性。结果显示，该方法的线性范围为102～108 CFU/mL（R2＝0.995），检测限低至1 CFU/mL，且特异性良好，与金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、单核细胞增生李斯特菌均无交叉反应。此外，本实验构建的检测方法在不同阪崎克罗诺杆菌浓度（104、105、106 CFU/mL）的乳品样品（牛奶和婴幼儿配方乳粉）中回收率为89.51%～104.71%。综上，本研究建立了一种基于CRISPR/Cas12a的阪崎克罗诺杆菌荧光检测方法，具有良好的灵敏度和特异性，可为乳品中阪崎克罗诺杆菌的快速和灵敏检测方法的开发提供新参考。