《Human Pathology》：RNA NGS Testing Provides Additional Diagnostic and Prognostic Information Over Metaphase Karyotyping in Routine Clinical Evaluation of Acute Leukemias and Chronic Myeloid Neoplasms
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RNA测序技术通过锚定多重PCR富集策略，可检测血液肿瘤中融合基因及KMT2A PTD等剪接变异，弥补传统核型分析遗漏（56%异常），辅助WHO5/ICC分类（77%）及预后评估（21例），为临床提供额外诊断信息。
作者：Shikha Malhotra、Zheng Jin Tu、James R. Cook
部门：克利夫兰诊所病理学与实验室医学系，俄亥俄州克利夫兰
摘要
根据2022年国际白血病分类委员会（ICC）和世界卫生组织-血液学协会（WHO-HAEM5）的新分类标准，致病性融合基因在急性白血病和慢性髓系肿瘤的诊断与分类中变得越来越重要。虽然基于DNA的下一代测序（NGS）技术现已得到广泛应用，但基于RNA的NGS技术尚未在常规临床实践中普及。通过使用锚定多重PCR富集等技术，即使不知道融合伴侣基因的身份，RNA NGS也能检测到融合基因，并能识别出具有预后意义的剪接变异，包括KMT2A部分串联重复（PTD）和IKZF1缺失。我们回顾了在一个实际病例系列中（共350名患者，包含63个DNA基因和107个RNA基因）使用该技术的研究结果。在350名患者中，有70名（20%）的RNA NGS分析结果异常。其中68名（97%）患者进行了中期核型分析，结果显示：30名（44%）患者的RNA NGS和核型结果一致；而38名（56%）患者的RNA异常无法通过核型分析单独检测出来，其中包括14例KMT2A-PTD、7例IKZF缺失以及17例携带其他融合基因的病例。RNA NGS结果在51例患者中明确了特定的ICC或WHO诊断类别，并在另外21例患者中提供了预后相关信息。基于RNA的NGS检测能够在部分急性白血病和慢性髓系肿瘤中识别融合基因或致病性剪接变异。RNA NGS检测提供的额外诊断和预后信息通常是单纯通过中期核型分析无法获得的。基于RNA的融合基因检测是造血系统肿瘤诊断和管理中的有用辅助手段，可以方便地纳入常规临床实践。
引言
造血系统肿瘤根据临床表现、形态学特征、免疫表型和分子遗传学特征被划分为不同的临床病理类型1, 2。融合基因通常是由平衡易位产生的，是许多已知肿瘤的诊断依据之一，典型的例子包括t(9;22)(q34;q11.2) BCR::ABL1和t(15;17)(q24;q21) PML::RARA，分别与慢性髓系白血病和急性早幼粒细胞白血病相关3, 4, 5, 6。因此，识别特定的重复融合基因是疑似血液系统恶性肿瘤常规评估的重要部分。
融合基因可以通过多种方法检测到5, 7, 8。传统上，中期细胞遗传学研究是骨髓评估的一部分。虽然中期核型分析可以检测到许多与急性白血病或髓系肿瘤相关的常见平衡易位，但某些具有临床和诊断意义的异常在带状核型分析中难以发现，例如与儿童B淋巴细胞白血病相关的t(12;21)(p13;q22) ETV6::RUNX1，以及急性髓系白血病中的一些KMT2A重排11, 12。荧光原位杂交（FISH）技术能够检测许多重排，包括那些在标准中期核型分析中难以发现的异常13, 14, 15。直到最近，针对常见重复融合基因的FISH探针组合一直是骨髓相关恶性肿瘤检测的首选方法。随着对许多造血系统肿瘤分子机制理解的不断深入，当前第5版WHO分类和国际共识分类中定义了超过40种由重复融合基因引起的急性白血病或髓系肿瘤类型1, 2。FISH探针组合难以检测如此大量的潜在异常，因此需要新的技术。
基于RNA的下一代测序（NGS）技术能够在一次检测中识别大量可能的融合基因16, 17, 18。我们开发了一种基于锚定多重PCR的RNA-NGS检测方法，能够以不依赖于特定融合伴侣基因的方式检测107个目标基因中的任何融合事件。该检测方法还能识别具有预后意义的剪接变异，如KMT2A部分串联重复（PTD）19, 20或IKZF1的外显子水平缺失21, 22。在本研究中，我们描述了在350名连续患者中应用这种RNA-NGS技术的实际经验，并将其结果与同期进行的中期核型分析进行了比较，以评估该技术在诊断和预后评估中的附加价值。
病例选择
我们选取了一组由临床医生和/或血液病理学家在一年内连续安排检测的434例病例作为初始队列。从电子病历中检索并审查了相关的临床和实验室信息，包括病理诊断、核型分析和FISH结果。
RNA NGS分析
使用Maxwell RSC仪器和Maxwell RSC RNA试剂盒从外周血、骨髓或福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）切片样本中提取RNA。
结果
在最初的434例连续病例中，有8例无法进行RNA测序，7例临床数据不完整，69例为复检或重复检测，因此最终纳入研究的病例为350例来自不同患者的独立病例。如表1所示，70例（20%）患者的RNA NGS分析结果异常。在70例中，有54例（77%）检测到了在第5版WHO分类[2]或国际共识分类[1]中定义的特定诊断类别相关的融合基因。
讨论
在过去20年中，分子检测在血液系统肿瘤的诊断和分类中的作用显著增强16, 17。基于DNA的检测技术（如PCR或Sanger测序）针对NPM1、FLT3和CEBPA等基因的突变，在2008年WHO分类发布后成为常规检测方法27，该分类强调了这些标志物在AML分类和预后评估中的重要性。随着对更多血液系统肿瘤分子机制的认识不断深入，目前第5版WHO分类和国际共识分类中包含了由重复融合基因定义的40多种急性白血病或髓系肿瘤类型1, 2。传统的FISH探针组合难以检测如此大量的潜在异常，因此需要新的技术。
CRediT作者贡献声明
James R. Cook：概念设计、数据整理、数据分析、研究实施、方法学设计、项目管理、监督、初稿撰写及修订。
Shikha Malhotra：数据整理、数据分析、研究实施、方法学设计、项目管理、初稿撰写及修订。
Zheng Jin Tu：数据整理、数据分析、方法学设计、撰写及修订。
