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制备pH对BSA-CGA共轭物界面行为及β-胡萝卜素乳液稳定性的影响研究。通过电化学氧化在不同pH（5.0、7.0、8.0）合成共轭物，发现pH升高导致酚类氧化降解，共轭物表面电荷和分子柔韧性差异显著。pH7.0共轭物形成最厚界面层（≈40nm）且表面电荷适中，兼具最佳抗氧化活性与乳液稳定性，pH8.0共轭物因强负电导致界面层薄且稳定性下降。研究揭示了pH调控蛋白-多酚共轭物界面功能的新策略。
文振兆|文金库|叶金顺|李玉婷
中国东莞工业大学生命与健康技术学院，国家轻工业健康食品开发与营养调控重点实验室，东莞典型食品精密设计重点实验室，健康食品设计与营养调控工程研究中心，中国东莞523808
摘要
制备时的pH值可能对牛血清白蛋白（BSA）-绿原酸（CGA）共轭物的界面行为及其对β-胡萝卜素乳液的稳定效果具有决定性影响。在本研究中，我们在pH 5.0、7.0和8.0的条件下通过电化学氧化法合成了BSA-CGA共轭物。较高的pH值促进了BSA的醌介导的共价修饰。然而，表观接枝率（反映残留的酚类物质含量）从59.47 ± 1.12%下降到38.51 ± 1.53%，主要是由于CGA在碱性条件下的氧化降解。所有共轭物相比天然BSA都具有更高的分子灵活性。尽管pH 5.0条件下的共轭物能有效降低界面张力，但其有限的扩散性和表面电荷阻碍了稳定多层膜的形成，导致乳液中的液滴较大（1743.47 ± 26.23 nm）且ζ电位较低（6.91 ± 0.81 mV）。相比之下，pH 7.0和8.0条件下制备的共轭物能够稳定乳液，使液滴更小且ζ电位更高。pH 7.0条件下的共轭物表现出适度的疏水性、最厚的界面膜（约40 nm）以及相对较快的扩散速度；而pH 8.0条件下的共轭物带有较强的负电荷，这阻碍了多层结构的形成，使得界面层更薄。pH 7.0和8.0条件下制备的共轭物稳定的乳液具有优异的抗氧化性和环境稳定性，显著减少了β-胡萝卜素的降解并提高了其生物利用度。值得注意的是，pH 7.0条件下制备的共轭物不仅具有更强的抗氧化活性，还形成了更厚的界面膜，从而提供了最大的抗氧化保护。这些发现为通过调节pH值设计蛋白质-多酚共轭物作为抗氧化乳化剂提供了策略。
引言
基于蛋白质的水包油（O/W）乳液被广泛用于功能性食品中，作为疏水性生物活性化合物（如β-胡萝卜素）的输送系统（Manzoor等人，2023年）。然而，许多天然球状蛋白质由于其刚性构象和有限的分子灵活性，表现出较差的界面吸附和重组能力。这阻碍了致密、粘弹性的界面膜的形成，并使乳液在离子强度或温度变化时容易发生聚集或相分离（Zhang、Liu等人，2025年）。此外，脂质氧化和脂质-蛋白质共氧化会破坏界面保护层，加速封装活性物质的降解，并产生潜在的有毒产物；事实上，乳液系统中超过60%的β-胡萝卜素损失可归因于界面的氧化损伤（Gong等人，2022年；Mao等人，2018年）。因此，亟需开发兼具良好界面活性和强抗氧化能力的蛋白质基乳化剂，以提高乳液的物理和化学稳定性。
蛋白质与多酚的共价结合已成为满足这一需求的有效方法。共价结合的多酚可以改善蛋白质的界面吸附和重组能力，同时清除自由基并螯合金属离子，从而增强乳液的物理稳定性和抗氧化性（Liu等人，2025年；Zheng等人，2022年）。先前的研究表明，如乳铁蛋白-EGCG和蛋清蛋白-儿茶素这样的共轭物显著改善了乳液中液滴的特性、ζ电位以及β-胡萝卜素的储存稳定性（Gu等人，2017年；Sun等人，2024年）。然而，蛋白质-多酚共轭物的形成和性质高度依赖于pH值：pH值控制着蛋白质的离子化和构象、多酚的氧化还原行为以及反应路径，最终决定了共轭物的结构和功能（Li等人，2016年；Li等人，2020年）。传统的制备方法（如酶氧化、碱性自氧化和自由基接枝）通常受特定pH范围的限制，限制了对pH值-结构-功能关系和界面行为的系统分析（Quan等人，2019年）。我们之前的工作基于控制电位库仑法，实现了在不同pH条件下精确合成蛋白质-多酚共轭物（Ye等人，2025年）。通过这种方法，系统地阐明了pH值对所得共轭物结构特性和功能特性的影响（Ye等人，2025年）。然而，这些共轭物的界面性质及其在稳定含有亲脂性生物活性化合物的O/W乳液中的潜在应用仍需进一步研究。
牛血清白蛋白（BSA）是一种性质明确的球状蛋白质，具有高溶解度和良好的乳化性能。其显著的界面吸附能力和构象重组能力使其成为封装脂溶性生物活性化合物的常用乳化剂。然而，对于像β-胡萝卜素这样的易氧化化合物，仅靠蛋白质的界面稳定往往不足以防止加工和储存过程中的氧化降解和应力诱导的不稳定。这一局限性突显了将抗氧化功能整合到蛋白质基乳化剂中的必要性。BSA含有可参与与多酚共价结合的活性巯基和氨基，为同时调节界面性质和增强抗氧化性能提供了可行策略（Bayati & Poojary，2025年；Yan等人，2020年）。绿原酸（CGA）是咖啡酸和奎宁酸的邻二羟基苯酯，具有强抗氧化活性。在我们之前的研究中，我们证明了在不同pH条件下通过电化学氧化将BSA与CGA共价结合，显著提高了蛋白质的抗氧化活性和乳化稳定性（Ye等人，2025年）。这些功能改进与共价结合过程中发生的pH依赖性结构变化密切相关（Ye等人，2025年）。因此，有理由假设所得共轭物的界面行为以及含有脂溶性生物活性化合物的稳定乳液的稳定性和生物利用度也可能强烈依赖于制备时的pH值。因此，在本研究中，我们在酸性（pH 5.0）、中性（pH 7.0）和微碱性（pH 8.0）条件下通过电化学氧化合成了BSA-CGA共轭物，并将其用作乳化剂来稳定含有β-胡萝卜素的O/W乳液。通过表征这些共轭物的分子和界面性质，以及评估乳液的物理和抗氧化稳定性及β-胡萝卜素的体外生物利用度，阐明了反应pH值在调控BSA-CGA共轭物界面功能和乳化性能中的作用，这些共轭物用于封装亲脂性生物活性化合物。
化学试剂
牛血清白蛋白（BSA，≥98%）、绿原酸（CGA，≥95%）、胰蛋白酶（猪胰腺，T4799）、胃蛋白酶（猪胰腺，P6887）、胰酶制剂（猪胰腺，P7545）和胆汁提取物（猪胰腺，B8361）均购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。Coomassie Blue超快染色溶液购自Beyotime Biotechnology有限公司（中国上海）。单分散聚苯乙烯乳胶珠购自江苏智川科技有限公司。玉米油购自Xiwang
CGA表观接枝率和SDS-PAGE分析
如图1A所示，在不同pH值下制备的BSA-CGA共轭物的CGA表观接枝率存在显著差异（P < 0.05）。随着pH值的增加，表观接枝率从pH 5.0时的59.47% ± 1.12%下降到pH 8.0时的38.51% ± 1.53%。这一结果表明，pH 5.0更有利于形成具有较高表观接枝率的BSA-CGA共轭物（Pérez等人，2023年），而在较高pH值下接枝程度显著降低。先前研究
结论
随着pH值的增加，BSA的醌介导的共价修饰得到增强。然而，在碱性条件下，多酚更容易发生氧化降解，导致表观接枝率降低。在不同pH值下制备的共轭物相比天然BSA具有更高的分子灵活性。尽管如此，那些在BSA等电点附近制备的共轭物尽管灵活性增强，但表现出更高的亲水性和更低的表面电荷，这限制了它们的
CRediT作者贡献声明
文振兆：撰写——原始草稿，验证，实验研究。文金库：实验研究。叶金顺：实验研究。李玉婷：撰写——审稿与编辑，项目管理，方法学设计，资金申请。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（编号：32272320）和广东省基础与应用基础研究基金（编号：2024A1515140155）的支持。作者感谢东莞工业大学分析测试中心的协助。
