开发并优化了Fe?O?@SiO?-黄嘌呤氧化酶磁性纳米颗粒，利用分子对接技术快速筛选来自蛇瓜（Trichosanthes anguina）的黄嘌呤氧化酶（XOD）抑制剂
《International Journal of Biological Macromolecules》：Development and optimization of Fe?O?@SiO?-xanthine oxidase magnetic nanoparticles for rapid screening of XOD inhibitors from
Trichosanthes anguina (snake gourd) with molecular docking approach
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XOD抑制剂的天然来源筛选及机制研究。通过构建Fe?O?@SiO?-XOD磁纳米粒子平台，成功实现蛇瓜提取物中11种黄酮类化合物的富集与鉴定，其中6种具有显著XOD抑制作用（IC50 77.17-383.50 μg/mL），分子对接显示与XOD活性位点强结合（-6.6至-8.3 kcal/mol）。细胞模型验证显示富集组分能剂量依赖性降低UA生成（与别嘌呤醇相当），且不具细胞毒性。该平台为天然XOD抑制剂的高效筛选提供了新策略，并证实蛇瓜是尿酸代谢调控的潜在资源库。
Zain Ullah|Zihao Yan|Min Zhang|Peng Liu|Panpan Yue|Guangying Chen|Ting Zhao|Liuqing Yang
江苏大学化学与化学工程学院，中国镇江学府路301号，212013
摘要
黄嘌呤氧化酶（XOD）抑制剂在管理高尿酸血症和痛风方面起着核心作用，但高效、可重复使用的基于酶的筛选平台仍然有限。在这项研究中，开发并优化了固定了Fe?O?@SiO?纳米颗粒（Fe?O?@SiO?-XOD NPs）的筛选平台，并将其应用于从Trichosanthes anguina（蛇瓜）中鉴定生物活性XOD抑制剂。Fe?O?@SiO?-XOD NPs通过戊二醛介导的交联反应合成，并通过FTIR、XRD和SEM进行了表征。最佳固定条件为：戊二醛浓度15%，pH值7.5，温度25°C，孵育时间1小时。经过八次重复使用后，固定化的酶仍保留了超过65%的活性，并且对活性配体表现出高特异性（使用别嘌醇进行了验证）。利用该平台，Trichosanthes anguina的乙醇提取物对XOD的抑制浓度IC??为383.50 ± 11.98 μg/mL，而通过配体富集得到的组分显示出显著增强的抑制效果（IC?? = 77.17 ± 6.80 μg/mL）。UPLC-Q-TOF-MS/MS分析鉴定了十一种黄酮类化合物，其中六种具有潜在的XOD抑制作用，分子对接实验显示它们与XOD活性位点的结合亲和力很强（?6.6至?8.3 kcal/mol），涉及多个氢键和疏水相互作用。此外，在由XOD和腺苷诱导的HK-2细胞模型中，配体富集组分在非细胞毒性浓度下显著且剂量依赖性地降低了尿酸（UA）的产生，其效果与别嘌醇相当。总体而言，Fe?O?@SiO?-XOD NPs平台为筛选天然XOD抑制剂提供了一种高效且可重复使用的策略。Trichosanthes anguina被证实是抗高尿酸血症黄酮类化合物的丰富来源，为其进一步用于痛风管理提供了依据。
引言
黄嘌呤氧化酶（XO）是一种含有钼的酶，在嘌呤代谢过程中将次黄嘌呤转化为黄嘌呤，进而转化为尿酸（UA）[1]，[2]。在其他哺乳动物中，尿酸酶会进一步将UA转化为可溶于水的所有亭醇形式，但在人类和密切相关的灵长类动物中，这种尿酸酶基因发生了突变，导致它们无法将UA转化为更易溶的形式。UA浓度的增加会导致一种称为高尿酸血症（HUA）的状况[1]，[3]。UA会在身体各部位形成单钠尿酸盐（MSU）晶体，引发严重的炎症和疼痛。这种情况会增加痛风的发生率，损害肾脏，并导致慢性间质性肾炎[4]，[5]。因此，抑制XO活性以避免与UA相关的并发症和HUA及相关疾病非常重要[6]。
饮食调节已被证明在改善HUA症状方面起着重要作用。早期研究表明，食物的降尿酸潜力与其活性成分密切相关[7]，[8]，[9]。例如，富含生物活性化合物的食物，如绿茶中的多酚、紫薯和蓝莓中的黄酮类、绿咖啡豆中的酚酸、葡萄中的芪类、根茎草本植物中的生物碱、大麦中的肽、Lonicera japonica中的多糖等，已被研究用于抑制XO，且副作用最小[10]，[11]，[12]。研究结论认为，食物来源的化合物在抑制XO和降低UA方面具有良好的应用前景[11]，[13]，[14]。
每种植物都含有许多化合物，但从这种复杂的基质中分离目标化合物是一个瓶颈问题，限制了天然XO抑制剂的发展[15]。目前，传统的分离方法（如LC（液相色谱）可能分辨率和效率较低，尤其是在复杂混合物中。溶剂萃取和蒸馏往往导致分离不完全，并可能降解敏感化合物。先进的技术，如超声波萃取、膜分离和固相萃取，可能会产生不一致的结果，在选择性、结合能力和重复性方面存在问题[15]，[16]。因此，需要更高效和创新的筛选技术来分离和鉴定有效的天然化合物[17]。近几十年来，磁性纳米颗粒（Fe?O?/Fe?O?@SiO?）在生物和医药领域引起了广泛关注，因为它们具有高磁响应性和稳定性[18]。使用磁性NPs印迹聚合物从天然植物中分离化合物是一个不错的选择，因为该技术可以提供高产率和纯度，并且能够更快更高效地分离目标化合物[6]，[19]。固定了酶的磁性二氧化硅纳米颗粒在从复杂天然产物中特异性捕获XO结合剂方面具有巨大潜力[20]。实验结果表明，所开发的方法可以无需纯化复杂样品即可选择性地捕获和分析XOD结合剂[21]。
Trichosanthes anguina Linn.属于葫芦科，是一种温带作物，在东南亚和东非的多个地区种植，其果实具有营养价值[22]。Trichosanthes anguina在许多国家被称为蛇瓜、蝰蛇瓜或长番茄，是从营养角度来看对人类和动物健康至关重要的营养来源[17]。除了基本营养成分外，这种植物还富含多种功能性成分，如三萜类、黄酮类、类胡萝卜素、酚酸以及可溶性和不可溶性膳食纤维和必需矿物质，使其在药理学和治疗学上具有活性，并具有潜在的经济价值，具有食品、医药和观赏价值[23]，[24]，[25]，[26]。药理活性研究表明，该植物含有抗糖尿病、细胞毒性、保肝、护胃和抗炎成分[27]。在古代医学中，T. cucumerina被用于治疗头痛、脱发、发热、腹部肿瘤、胆汁淤积、疖子、急性绞痛性腹泻、血尿和皮肤过敏[22]，[28]，[29]，[30]。它在阿育吠陀和Siddha等医学体系中占有重要地位[31]。这些植物的化学成分（如异黄酮苷和trichoanguin）已被报道具有抗肿瘤和抗HIV-1的特性[32]。
本研究旨在利用Fe3O4@SiO2-XOD NPs建立一种简单的协议，从Trichosanthes anguina中筛选XOD结合剂，并使用HPLC-Q-TOF-MS/MS鉴定配体。通过化学共沉淀和溶热法制备了基于XOD固定核心-壳层磁性二氧化硅涂层的纳米颗粒（Fe?O?@SiO?-XOD），以解决天然产物分离的问题。制备的纳米颗粒的形态、组成和磁性质通过FTIR光谱、X射线衍射（XRD）和扫描电子显微镜（SEM）进行了表征。还研究了最佳的酶固定条件。根据上述确定的最佳分离条件，在配体富集前后，通过分光光度法评估了Trichosanthes anguina乙醇提取物中的XO抑制剂。此外，在由XOD和腺苷诱导的HK-2细胞模型中验证了配体富集组分降低UA的效果，并通过CCK-8 assay评估了细胞活力。进一步使用HPLC-Q-TOF-MS/MS确定了活性成分的组成，揭示了Trichosanthes anguina活性物质在降低UA方面的作用及其应用潜力。
仪器
FT-IR（Nicolet iS50；Thermo Fischer Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆），UV-分光光度计（UV-25），微孔板读数器（Synergy HTX，美国Winooski），扫描电子显微镜（SEM）（Regulus 8100；日本东京Hitachi），X射线晶体学（XRD）（Empyrean，PAN analytical B.V.，荷兰），（Shimadzu，日本京都），HPLC，HPLC-Q-TOF-MS/MS（ACQUITY UPLC-BEH），Shim pack C-18 RP柱（250 × 4.6 mm，5 μm）。分析试剂盒（Jiancheng Biotech，中国南京）。
结果与讨论
在这项研究中，成功开发了Fe?O?@SiO?-XOD NPs，作为一种稳健且可重复使用的基于酶的平台，用于高效筛选天然XOD抑制剂。基于戊二醛介导的交联的固定策略实现了稳定的酶附着，同时保持了催化活性和磁性回收率。通过系统优化固定参数（包括戊二醛浓度、pH值、温度和孵育时间），得到了Fe?O?@SiO?-XOD
结论
在这项研究中，成功合成了Fe?O?@SiO?-XOD NPs，并通过FTIR、XRD和SEM分析对其进行了功能化和表征，证实了逐步的表面修饰和有效的酶固定。系统优化表明，戊二醛浓度15%、pH值7.5、温度25°C和孵育时间1小时是实现高XO固定效果的最佳条件。固定化的XOD表现出良好的重复使用性，保留了超过65%的活性
CRediT作者贡献声明
Zain Ullah：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，可视化，软件，方法学。Zihao Yan：可视化，概念化。Min Zhang：验证，概念化。Peng Liu：验证，概念化。Panpan Yue：可视化，软件，概念化。Guangying Chen：可视化，概念化。Ting Zhao：撰写 – 审稿与编辑，验证，方法学，概念化。Liuqing Yang：可视化，监督，项目管理，方法学，
致谢
本工作得到了教育部热带药用资源化学重点实验室开放基金会的支持[RDZH2025002]。
