《TRENDS IN FOOD SCIENCE & TECHNOLOGY》：Recent advances in the discovery, heterologous expression, protein engineering, and immobilization of cellobiose 2-epimerases
编辑推荐：
双挑战驱动乳糖高值化利用研究：环境治理与营养需求协同视角下，乳糖异构酶（CEases）的结构-功能关系解析及其工业应用优化策略。
杨思佳|李梦丽|张涛|苗明
江南大学食品科学与资源国家重点实验室，中国江苏省无锡市，214122
摘要
背景
乳糖不耐受以及乳清处理带来的环境污染双重挑战，迫切需要高效利用乳糖。纤维素二糖2-差向异构酶（CEases）作为一种有前景的生物催化剂，能够将乳糖转化为高价值的功能性糖类，特别是乳果糖和表乳糖。
范围与方法
本文全面概述了纤维素二糖2-差向异构酶的微生物来源、生化特性、结构特征及催化机制。此外，还重点分析了通过结构导向的动态工程提升酶活性、利用创新的无载体和纳米基质固定化技术提高操作稳定性，以及利用公认安全（GRAS）微生物宿主和动态控制系统优化规模化生产等方面的最新进展。
主要发现与结论
纤维素二糖2-差向异构酶在乳制品行业和功能性糖类合成中展现出巨大潜力。人工智能辅助的筛选方法显著加快了新型酶的发现速度。从机制层面来看，计算技术的突破使我们从基础性的差向异构化机制，深入理解到了调控这种双功能酶活性的动态“摆动机制”。基于这些机制见解，对结构动态的合理设计显著提升了酶的催化效率和产物选择性。同时，转向公认安全的微生物表达系统使得生产过程更加安全、符合食品级标准。未来的研究应进一步整合计算生物学与无重金属的固定化技术，以实现功能性糖类产业的规模化、零废物生物催化工艺。
引言
乳糖（4-O-β-D-半乳吡喃糖基-D-葡吡喃糖）由通过β-1,4-糖苷键连接的D-葡萄糖和D-半乳糖残基组成，是哺乳动物乳汁和乳制品中的主要碳水化合物（Deng等人，2024年）。然而，全球约70%的人口存在乳糖不耐受问题，在许多亚洲和非洲国家这一比例高达95%-100%（Li等人，2023年）。与此同时，乳制品行业产生了大量乳清，这是奶酪和酪蛋白生产的主要副产品，年产量约为2亿吨，增长率在1%-2%之间（Buchanan等人，2023年）。未经处理的乳清直接排放不仅浪费了乳糖资源，还会对环境造成严重威胁。因此，从乳制品副产品中生物转化乳糖成为当务之急，既能减轻环境负担，又能满足乳糖不耐受人群的营养需求。
乳糖可作为原料生产多种衍生物，包括差向异构化产物（表乳糖）、异构化产物（乳果糖）、转半乳糖基化产物（半乳寡糖、乳蔗糖）、氧化产物（乳酸内酯）和还原产物（乳糖醇）（Xiao、Chen、Guang等人，2019年）。其中，表乳糖和乳果糖因其益生元效应、低热量、促进消化和增强免疫系统等功能而备受关注（Wang、Wang等人，2022年；Xiong、Huang、Xu等人，2024年）。这些功能性糖类可由纤维素二糖2-差向异构酶（CEases；EC 5.1.3.11）催化生成。这类酶能将寡糖（如纤维素二糖、乳糖和甘露糖）还原末端 的D-葡萄糖残基转化为D-甘露糖或D-果糖残基（Chen、Xiao等人，2018年）。首种纤维素二糖2-差向异构酶于20世纪末从Ruminococcus albus ATCC 27210（RaCE）中分离得到（Tyler & Leatherwood，1967年）。此后，已从超过30种微生物来源中鉴定出该酶，它们具有多样的生化特性。广泛的结构和机制研究为理解其结构-功能关系奠定了坚实基础（Feng、Hua等人，2020年；Fujiwara等人，2013年、2014年）。目前，不同来源的纤维素二糖2-差向异构酶具有各自的优缺点。例如，Dictyoglomus属（DsCE）的酶具有最高的异构化活性（4.3 U mg?1），但在80°C下孵育80分钟后活性仅剩约30%（Huang、Ouyang等人，2024年）；而Dictyoglomus thermophilum（DtCE）在80°C下的半衰期（t1/2）为2小时，但其催化活性（3.52 U mg?1）低于< />CE（Xiao、Chen、Shakhnovich等人，2019年）。因此，进一步优化这些酶的酶学性质对于工业应用至关重要。
为克服这些固有局限性并满足严格工业要求，该领域最近经历了重大变革。新型纤维素二糖2-差向异构酶的发现不再局限于基于序列的同源性分析，而是借助人工智能工具和分子动力学（MD）模拟加速进行，从而精准筛选目标候选酶。从静态差向异构化模型到动态“摆动机制”的理解深化，揭示了这类双功能酶的双重活性。同时，蛋白质工程从静态活性位点修饰发展为对动态结构元素（如柔性环和底物通道）的合理优化，以精确控制产物选择性并显著提升催化效率。将这些优化后的生物催化剂转化为经济可行的工艺过程中，无载体和纳米基质固定化技术的应用日益重要，它们有效缓解了传质限制并提高了操作稳定性。为确保食品安全和工业规模化，研究人员越来越多地采用公认安全的微生物宿主。先进策略（包括动态控制系统的整合）被用于实现高滴度的细胞外分泌，同时消除内毒素风险。
本文全面总结了纤维素二糖2-差向异构酶的微生物来源、生化特性、结构特征及催化机制，特别强调了结构导向的蛋白质工程、创新固定化技术和可规模化异源表达方法的最新进展，并探讨了当前面临的挑战及未来发展方向，以实现其在功能性糖产业中的大规模、可持续应用。
部分摘录
纤维素二糖2-差向异构酶的微生物来源
该酶最初是在Ruminococcus albus培养液的上清液中发现的，它能催化纤维素二糖与4-O-β-D-葡吡喃糖基-D-甘露糖之间的可逆差向异构化反应（Tyler & Leatherwood，1967年）。随后，Ito等人（2007年）首次纯化了RaCE并确定了其基因序列。随着高通量测序技术的快速发展，微生物基因组序列的获取变得越来越容易，数量也在不断增加。
基因改造以提升纤维素二糖2-差向异构酶的性能
野生型酶通常存在催化活性低、热稳定性差和选择性有限的缺点。蛋白质工程已被证明是提升其性能的有效方法。表2总结了近期在纤维素二糖2-差向异构酶分子改造方面的研究进展。在所有已报道的酶中，CsCE因其优异的热稳定性和高效的异构化能力而成为改造的主要对象（如图2所示）。纤维素二糖2-差向异构酶的固定化
为解决纯化酶的不稳定性和高操作成本问题，固定化技术被广泛用于提高操作稳定性，实现大规模生物转化中的重复使用和经济可行性。目前，已有多种固定化方法应用于纤维素二糖2-差向异构酶，主要包括物理吸附、包埋、交联和共价结合等，既可使用传统商用树脂，也可采用创新功能材料。提升纤维素二糖2-差向异构酶的异源表达
目前已成功鉴定出具有不同酶学特性的纤维素二糖2-差向异构酶，其中一些通过蛋白质工程得到了进一步优化。然而，天然菌株的表达水平远低于预期，限制了其工业应用。为解决这一问题，近期研究重点开发了异源表达系统以实现高产。虽然大肠杆菌曾是首选宿主，结论与未来展望
本文综述了纤维素二糖2-差向异构酶在发现、生化特性、蛋白质工程、固定化和异源表达方面的最新进展。然而，我们发现当前研究进展与实际工业应用之间存在显著差距。理想的工业用纤维素二糖2-差向异构酶需满足三个核心要求：（1）极高的产物选择性，以最小化结构相似的副产物（例如在乳果糖合成过程中产生的表乳糖）。
CRediT作者贡献声明
杨思佳：数据整理、数据分析、可视化、初稿撰写。李梦丽：概念构思、监督、资金获取。张涛：概念构思、数据分析、资金获取、审稿与编辑。苗明：数据分析、审稿与编辑。
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了中国山东省重点研发计划（2024CXGC010615）和江苏省优秀博士后人才资助计划（2024ZB323）的财政支持。
