《Resources Environment and Sustainability》：Unraveling antibiotic resistance gene hotspots in mass-reared insects’ manure compost: A comparative study of traditional and industrialized sericulture
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本刊推荐：为应对工业化昆虫养殖产生大量粪便所带来的抗生素抗性基因（ARGs）传播风险，研究人员对传统（TSE）与工业化（ISE）蚕桑养殖的蚕粪堆肥过程进行了系统比较。研究发现，TSE堆肥中ARGs富集与病原体紧密关联，而ISE堆肥中则主要受抗生素使用驱动。通过宏基因组分析，研究揭示了ARGs的关键宿主和移动遗传元件（MGEs）组合，并利用ARG-MGEs距离指数和堆肥-土壤微宇宙实验验证了TSE组具有更高的ARGs传播风险。该研究首次为昆虫粪肥堆肥的ARGs风险评估提供了生态技术学见解，对指导可持续昆虫生物资源生产具有重要意义。
随着全球人口增长，昆虫作为替代性食物和饲料来源备受关注。其中，家蚕（Bombyx mori）不仅以产丝闻名，其蚕蛹也是高蛋白的营养来源。近年来，以中国浙江为首个基地的“蚕虫工厂”应运而生，显著提高了蚕蛹产量。然而，现代动物生产往往伴随着抗生素的过度使用，蚕虫工厂也不例外。抗生素的使用会直接导致动物粪便中抗生素抗性基因（Antibiotic Resistance Genes, ARGs）的富集，而粪便正是ARGs的储存库。这些ARGs可通过水源甚至气溶胶影响周边环境的人类抗性组，构成重大健康风险。与此同时，动物产量的增加导致了大量粪肥积累，从而加剧了ARGs风险。例如，首个大型工业化养蚕工厂（约15公顷）的一期运营每年产生约2万吨粪便，突显了这一新兴产业巨大的废弃物产生潜力。因此，管理昆虫粪便中的ARGs已成为制约工业化昆虫养殖发展的关键因素。
堆肥是处理各种农业废弃物，特别是动物粪便的高效方法。它可以将固体有机废物转化为稳定、无害的有机肥料。近年来，由于畜禽粪便中ARGs的高风险，堆肥去除ARGs的能力受到广泛关注。高效的堆肥可实现92%的ARGs去除率。然而，针对昆虫粪便堆肥中ARGs风险的研究较少，尽管这对于可持续动物生产至关重要。
ARGs之所以备受关注，是因为它们可以通过移动遗传元件（Mobile Genetic Elements, MGEs）（如质粒、整合子）介导的水平基因转移（Horizontal Gene Transfer, HGT）进行传播。例如，磺胺类抗性基因sul1是堆肥中常检测到的ARG，常由1类整合子携带。此外，在将堆肥施用于土壤时，这些与MGEs共定位的ARGs可能更容易转移到土壤微生物中，从而加剧土壤污染。因此，识别堆肥中的MGEs并定量评估ARGs的转移风险，对于减轻其对生态系统和人类的潜在传播链至关重要。
为了探究这些问题，由Xiaoqiang Shen、Lichao Chen、Enhui Guo、Huarui Zhang、Jintao He、Chao Sun、Abrar Muhammad和Yongqi Shao组成的研究团队，在《Resources Environment and Sustainability》上发表了一项研究。他们利用宏基因组组装和分箱方法，解析并比较了传统蚕桑养殖（TSE，即家庭规模桑园饲养）和工业化蚕桑养殖（ISE，即工厂规模人工饲料饲养）的蚕粪堆肥过程中，ARGs、其潜在宿主及相关传播风险的时序动态。研究主要回答了五个问题：1）工业化生产是否重塑了抗性组，特别是堆肥各阶段ARGs的传播风险；2）哪些MGEs和连锁模式（如ARG–MGE共定位/邻近性和核心ARG–MGE模块）构成了ARG传播风险差异的基础；3）哪些细菌宿主是ARGs的主要储存库和潜在传播者；4）堆肥施用是否会改变土壤抗性组；5）哪些关键的生物和非生物驱动因素塑造了观察到的ARGs动态。
本研究采用了宏基因组测序、生物信息学分析与微宇宙实验验证相结合的技术体系。研究材料包括来自浙江本地农户的传统蚕桑养殖蚕粪和来自浙江蚕虫工厂的工业化养殖蚕粪。堆肥系统在实验室条件下建立，将蚕粪与玉米秸秆按体积比3:1混合，并按照堆肥的四个典型阶段（中温期、高温期、降温期、腐熟期）进行采样。通过对样本进行DNA提取和宏基因组鸟枪法测序，获得了用于分析的序列数据。在生物信息学分析中，研究人员使用ARGs-OAPv3、MGE数据库和VFDB数据库分别注释和量化了抗生素抗性基因（ARGs）、移动遗传元件（MGEs）和毒力因子基因（VFGs）。利用宏基因组组装和多种分箱工具（如MetaBAT2、MetaDecoder、Binny、SemiBin2）重建了宏基因组组装基因组（Metagenome-Assembled Genomes, MAGs），以鉴定ARGs的宿主微生物。为了评估ARGs的传播风险，研究计算了ARG与MGE在重叠群上的最短基因组距离（ARG-MGE距离），距离越短，传播风险越高。此外，还设计了一项堆肥-土壤微宇宙实验，以sul1基因为指示基因，验证堆肥中ARGs向土壤的实际传播潜力。最后，运用结构方程模型（Structural Equation Modeling, SEM）分析了温度、堆肥性质、细菌群落组成和MGEs组成对ARGs组成的直接和间接影响。
3.1. 堆肥过程中ARGs和MGEs的变化
研究结果显示，堆肥显著降低了两组中ARGs的丰度。TSE组ARGs丰度降低了84.11%，ISE组降低了59.28%。高温期是ARGs减少的主要阶段。两组堆肥初始样品的ARGs组成存在显著差异：TSE组以多重耐药ARGs（超过30%）为主，其次是MLS（大环内酯类-林可酰胺类-链阳菌素类，26%）和β-内酰胺类（10.2%）ARGs；而ISE组则以MLS ARGs（66.1%）为主。这种差异归因于不同的养殖模式：TSE组中较高的多重耐药ARGs丰度与病原体丰度较高有关，而ISE组中MLS ARGs的富集则与饲料中检测到的罗红霉素和林可霉素盐酸盐等抗生素的使用有关。值得注意的是，尽管在ISE组饲料中检测到高浓度的磺胺类和喹诺酮类抗生素残留，但相应的ARGs并未富集，反而氨基糖苷类和氯霉素类ARGs丰度显著增加，这表明抗生素选择压力与富集的ARG类型之间存在不匹配现象。在腐熟期，两组的ARGs组成都发生了变化，但都富集了与四环素类、氯霉素类和氨基糖苷类抗生素相关的ARGs，这些是在商品化堆肥中广泛存在且持久性的ARGs。此外，ISE组在降温期出现了ARGs丰度的反弹，这可能与其高温期温度（58°C）低于TSE组（68°C），导致更多ARGs宿主存活并在温度适宜时重新定殖有关。MGEs的动态变化与ARGs相似，其丰度在堆肥过程中也显著下降。在堆肥过程中，TSE组质粒的比例逐渐下降，而ISE组质粒的比例显著增加。然而，对质粒的重构分析显示，在两组中，可移动质粒（接合型和可移动型）占总质粒的比例均不足1%，且ISE组可移动质粒的比例始终显著低于TSE组，表明TSE组可能存在更高的ARGs传播风险。与鸡粪堆肥、猪粪堆肥和商品化堆肥相比，TSE腐熟堆肥的ARGs总丰度最低，而ISE组最高。在临床相关ARGs的分析中，TSE组具有最高优先级ARGs的比例最高（21.69%），而ISE组最低（12.91%）。
3.2. 抗性组和移动组的共现模式
线性回归分析显示，两组中MGEs与ARGs丰度均呈显著正相关。共现网络分析表明，TSE组的相互作用网络更为复杂，具有更多的相关边和更大的平均度，表明其ARGs转移风险可能更高。值得注意的是，多重耐药ARGs与所有MGE类别的显著关联仅出现在TSE组，且TSE组的VFGs与ARGs和MGEs有更多的相关边，进一步证实了病原体在塑造TSE组抗性组中的主导作用。核心MGE分析显示，在TSE组，质粒是核心MGE（与80.0%的ARGs共现）；在ISE组，转座酶和质粒是核心MGEs。分层分割分析表明，在TSE组，质粒解释了33.74%的ARGs变异，而在ISE组，插入序列和转座酶分别解释了34.95%和34.71%的ARGs变异。
3.3. ARGs和MGEs的宿主识别
通过宏基因组分箱，从TSE组和ISE组分别重建了116个和52个高质量MAGs。在TSE组鉴定出71个ARGs携带者，在ISE组鉴定出48个。同时携带ARGs和MGEs的高风险MAGs在TSE组主要来自假单胞菌门（Pseudomonadota）和放线菌门（Actinomycetota），在ISE组主要来自厚壁菌门（Bacillota）。在TSE组，每个假单胞菌门MAG平均携带20个ARGs，显著高于其他菌门；而在ISE组，每个厚壁菌门MAG平均携带5个ARGs。TSE组中52.1%的高风险MAGs同时携带VFGs，被认为是潜在病原体，该比例在ISE组为33.3%。研究鉴定出包括Leclercia pneumoniae、Pantoea leporis、Enterobacter quasihormaechei和Enterobacter cancerogenus在内的多种已知机会性病原体，它们携带大量多重耐药ARGs。
3.4. ARG传播风险的动态变化
通过计算ARG与MGE之间的平均最短距离（ARG-MGE距离）来评估传播风险。结果显示，TSE腐熟堆肥的ARG-MGE距离显著短于ISE组，表明其ARGs传播风险更高。在整个堆肥过程中，两组的传播风险均在中温期向高温期转变时下降，在降温期向腐熟期转变时回升。但从整体趋势看，TSE组的ARG传播风险呈上升趋势，而ISE组呈下降趋势，这可能与微生物网络复杂性的变化有关。与水产养殖系统、人类肠道和土壤相比，堆肥中ARGs的传播风险最高（平均ARG–MGE距离约0.8 kb）。堆肥-土壤微宇宙实验进一步验证了这一点：施用TSE堆肥的土壤在30天后，其sul1基因丰度显著高于施用ISE堆肥的土壤。研究还识别了堆肥过程中的高风险ARGs及其动态变化，并发现超过50%的ARGs与特定的MGEs（如sul1、tetG与qacEdelta）形成了稳定的组合，这些核心基因模块可能在ARGs的水平转移中起关键作用。
3.5. 生物和非生物因素对抗性组的影响
结构方程模型（SEM）分析揭示了两组中驱动因素的差异。在TSE组，细菌群落组成是主要的生物因素，对ARGs有显著的直接效应。而在ISE组，MGEs是ARGs的直接驱动因素，细菌群落组成主要通过间接效应影响ARGs。这与TSE组病原体作用更突出、而ISE组受抗生素使用和科学管理影响更大的结果一致。非生物因素（温度和堆肥性质）在两组中均通过影响细菌组成和MGEs，对ARGs产生相似的间接影响。温度通过对细菌组成的负向间接效应影响ARGs，且这种效应在ISE组更为明显。
本研究全面揭示了传统与工业化蚕桑养殖模式下蚕粪堆肥过程中的ARGs特征。具体而言，TSE组中的ARGs与人类病原体广泛关联，且表现出较高的传播风险；而ISE组中的ARGs则与抗生素使用相关，其传播潜力显著较低。研究识别出大量稳定的ARG-MGE组合，为靶向减少ARGs提供了潜在策略。基于这些发现，研究提出了针对不同养殖模式的管理建议：传统模式应优先考虑卫生管理，以最大限度减少人类病原体的引入；而工业模式则应优化抗生素使用，以进一步降低堆肥中的ARGs丰度。作为宝贵的生物资源，用于食品、饲料和其他高价值材料的昆虫工业化生产正在快速增长，本研究揭示了不同的昆虫生产系统可能需要差异化的管理策略，这为昆虫资源生产的可持续发展和环境保护铺平了道路。
