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本期《生物化学》（Biochemistry）特刊“肽的化学与生物学”收录了这项前沿研究。该文首次将肽的天然化学连接（NCL）策略成功应用于类肽（peptoid）寡聚体的合成，通过C端酰肼（hydrazide）作为掩蔽的硫酯，实现了短链类肽片段在温和条件下的高效连接，形成天然的酰胺键。该方法克服了传统固相合成在制备长链、序列特异性的类肽大分子时产率下降的难题，为合成具有蛋白质模拟功能（如可形成二维纳米片）的类肽大分子提供了一种模块化的汇聚式合成新途径，推动了非天然序列大分子功能材料的开发。
在合成化学与聚合物科学领域，从天然生物聚合物（如蛋白质）中汲取灵感，设计具有序列-结构-功能关系的肽模拟物寡聚体，是一个重要的研究方向。然而，现有的迭代溶液相或固相合成方案虽然在获取多样化的寡聚物方面表现出色，但在实现类似蛋白质的长链长方面存在局限，这限制了合成具有明确三级结构和蛋白质模拟属性的序列定义大分子的可能性。与肽化学中已通过汇聚式合成方法（如天然化学连接，NCL）克服此限制不同，非天然序列定义大分子的高效合成路径亟需建立。本项研究旨在将NCL方法应用于类肽寡聚体，通过连接短链来创建序列定义的类肽大分子，并为合成具有多样化学特征的类肽蛋白模拟物提供可靠策略。
材料与方法
研究中使用的散装溶剂如N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、乙腈等购自VWR。所有合成试剂，包括伯胺、氨基酸、偶联剂和连接材料，均购自Millipore Sigma、Chem-Impex、Thermo Fisher Scientific或Ambeed。类肽寡聚体采用固相亚单体法手动或自动化合成。类肽C端酰肼的制备遵循Bird和Dawson建立的程序，从2-氯三苯甲基氯树脂获得酰肼树脂。连接反应在含有0.2 M NaH2PO4和6 M Gn·HCl的缓冲液（pH=3）中进行，C端酰肼类肽氧化反应在-15°C的冰盐浴中进行。连接产物通过分析型高效液相色谱（HPLC）和液质联用（LCMS）或超高效液相色谱-质谱（UPLC-MS）进行分析和确认。肽纳米片的形成在10 mM Tris-HCl、100 mM NaCl、pH 8的水缓冲液中，通过温和振荡过程诱导组装。组装后的纳米片使用尼罗红染料染色，在共聚焦荧光显微镜下进行成像。
结果与讨论
为实现类肽的NCL，需要制备带有C端酰肼的寡聚体以及带有N端巯基的配对寡聚体。最初的尝试表明，直接从酰肼树脂开始使用类肽固相亚单体合成难以得到产物。随后，研究改用N-甲基甘氨酸（肌氨酸）作为C端第一个残基，通过标准肽偶联条件引入第一个单体，然后使用标准的类肽亚单体循环成功合成了目标类肽。这类似于固相肽合成中对类似树脂连接体采用替代偶联条件的常见做法。
研究首先在短模型序列上验证了连接反应：C端酰肼类肽H-Npm-(Npl)3-Sar-NHNH2（类肽1）与N端巯基类肽H-Nte-(Npl)3-NH2（类肽2）。通过将胱胺选为巯基伯胺，保留了经典肽NCL的关键五元环中间体特征。研究人员假设两个类肽之间的NCL机制可能与传统的肽NCL几乎相同，唯一的区别在于S→N酰基转移涉及仲胺而非伯胺的亲核攻击。他们借鉴了Liu实验室开发的肽酰肼连接方案，在pH 3的水性缓冲液中进行酰肼氧化，随后在pH 7的缓冲液中进行连接。通过分析型HPLC和LCMS观察到一个新的主产物峰，其质谱信号与预期的连接产物类肽3相符。
在初步连接成功后，研究通过改变寡聚体中存在的侧链化学官能团来测试该反应的范围。为方便起见，肌氨酸最常被用作酰肼类肽的C端单体。研究也证明了另一种以N-Fmoc形式商业可得的类肽单体N-苄基甘氨酸，同样可以作为酰肼类肽（类肽4）的C端单体，并与类肽5连接形成预期产物（类肽6）。此外，研究探讨了N端含巯基单体的变体耐受性，例如使用了比常用Trt-胱胺多一个亚甲基的N端S-Trt-3-巯基丙基甘氨酸（类肽7）进行连接，也观察到了预期产物。在N端巯基之外还存在内部巯基的情况下，连接反应同样能够进行。这些连接反应均通过LCMS确认了产物的形成，部分反应的转化率接近90%。在分离纯化连接产物后，研究对类肽3进行了自由基脱硫处理，成功将其连接位点的巯基官能团转化为N-乙基甘氨酸。这一过程类似于在全化学合成蛋白质中使用NCL时，将必需的半胱氨酸残基转化为更稳定、更天然丰富的丙氨酸的常见策略。
随后，研究将NCL方案应用于单个带有N端巯基和C端酰肼的类肽六聚体的成环反应。在氧化线性前体类肽12的C端酰肼后，通过加入MPAA引发环化。分析显示，经过一夜反应，线性前体几乎完全转化为环状产物类肽13。
为展示该反应的进一步应用，研究将其用于制备类肽基纳米材料。类肽纳米片是已广泛开发的二维纳米材料，能够实现一系列功能属性。例如，先前的研究已证实，可以合成具有从亲水表面突出的环状结构的大型类肽纳米片，以实现分子识别。单个类肽链通过单层内寡聚体在空气-水界面的排列进行自组装，随后通过轻柔振荡和压缩空气-水界面坍塌形成二维纳米片。带有功能环的类肽纳米片通常需要合成具有相当链长的类肽寡聚体，因此NCL这类片段缩合方法可以极大地促进其合成。它不仅能够通过制备较短的类肽寡聚体来提高产率，其模块化的连接策略还为连接不同序列提供了便捷方法。
基于此，研究设计了可通过NCL连接形成具有环展示功能的类肽纳米片形成序列。所设计的类肽寡聚体片段使得连接所必需的巯基官能团在连接后位于环内。研究人员合成了多种通过NCL形成的类肽纳米片形成序列的变体。初始设计的类肽14和15，其N端嵌段包含多个带正电荷的侧链基团，C端嵌段包含带负电荷的侧链基团，这遵循了常规的类肽纳米片设计策略。通过分析型HPLC和质谱鉴定出了连接产物，并将连接液样品稀释到纳米片形成缓冲液中，通过振荡成功形成了目标类肽纳米片，并用荧光显微镜进行了观察。
值得注意的是，获得的主要连接产物的分子量比计算值大了29 Da。进一步分析确定，这种加合物是在氧化带有胺官能化的N端侧链的类肽片段时形成的，而非在后续连接步骤中。已知仲胺可能在酸性条件下与NaNO2产生的氧化性NO+物种反应形成N-亚硝胺。研究人员推测，在酸性条件下用NaNO2氧化带有胺基化N端侧链的类肽时，末端的仲胺被转化为N-亚硝胺。在预期连接产物的N端形成N-亚硝胺可以解释额外的质量。这种现象在之前进行的任何连接反应中均未观察到，这支持了N-亚硝胺因N端侧链内存在伯胺而稳定化，且邻近氨基烷基侧链的存在增强了其形成的假说。先前已有报道称，N端为脯氨酸的二肽在用酸性NaNO2处理时会形成N端N-亚硝胺。
为验证这一假设并确定其他纳米片形成序列是否可能出现相同现象，研究人员合成了类肽16和17。这些序列的连接产物是一个纳米片形成的类肽，其电荷排布与之前合成的相反（即负电荷侧链在N端嵌段，正电荷侧链在C端嵌段）。这些序列被连接，所得产物类肽18在温和振荡下组装成了纳米片。该连接产物的分子量与预期一致，没有+29 Da污染物的迹象。所形成的纳米片与先前研究中合成的环展示类肽纳米片相似。纳米片形成序列连接反应的估计转化率通常在50-70%之间。对连接反应的动力学研究显示，大部分产物在12小时内形成，同时观察到由类肽16形成的硫酯化中间体会在反应过程中水解，从而淬灭其参与连接的能力。这表明类肽NCL的效率受多种因素影响，包括类肽序列和浓度。这些因素可能导致研究中观察到的转化率存在差异，也为未来的优化提供了方向。
此外，研究还设计了一个环状插入片段系统，其中纳米片形成序列通过三个独立的类肽片段的两步连接来制备：一个带正电荷的N端片段、一个中间的环片段和一个带负电荷的C端嵌段。C端酰肼在氧化前对连接条件不反应，顺序连接可以在无C端保护基的情况下从N端到C端进行。中间产物在第一次连接反应完成后被分离，并作为第二次连接反应中的C端酰肼类肽使用。设计中在环内包含了一个炔基手柄，以说明通过铜催化叠氮-炔环加成（CuAAC）可以对序列进行额外的功能化。经过两次连接反应后，通过分析型HPLC和LCMS检测到了目标连接产物，最终产物也被振荡形成纳米片。利用这种方法，可以通过顺序连接三个类肽片段高效地制备一个展示环的类肽纳米片库，而无需合成和纯化冗长的最终片状形成寡聚体。稳定的侧翼锚定嵌段可以大量储存，这使得多种新的环展示片状形成类肽能够被制备，并且仅需要合成短的环序列。
该方法目前的一个限制是需要在类肽酰肼的C端残基使用氨基酸偶联化学。目前商业可用的N-Fmoc、N-取代甘氨酸单体种类有限，这限制了该位置可轻松获得的化学多样性。不过，可以合成所需的Fmoc保护的类肽单体。这一限制，加上另一类肽N端需要使用含巯基单体，对连接位点邻近残基的侧链多样性施加了一些约束。研究还注意到，在氧化带有胺基化N端侧链的类肽序列时，会发生副反应，即在N端形成N-亚硝胺。然而，与之前描述的其他寡聚体缩合技术相比，这些限制相对较小。
结论
本研究报道了利用肽NCL的一种变体方法来连接和成环化类肽片段，并利用该方案合成了二维纳米片形成序列。使用C端酰肼作为掩蔽的硫酯，促进了用于NCL的类肽的制备。这些结果展示了一种简单可靠的无保护寡聚体片段化学连接方法。研究人员预期，该策略将在未来制备序列定义的类肽大分子中发挥重要作用，为功能化类肽材料的设计与合成开辟了新途径。
