小鼠甲状腺激素转运体Mct8与Oatp1c1神经元特异性表达的缺失对海马依赖性神经元功能并非必需

《Frontiers in Endocrinology》：Neuron-specific expression of murine thyroid hormone transporters Mct8 and Oatp1c1 is dispensable for hippocampus-dependent neuronal functions

本研究通过构建GABA能神经元与谷氨酸能神经元特异性敲除小鼠模型，探究了甲状腺激素(TH)转运体Mct8/Oatp1c1的细胞自主功能。结果表明，两种神经元亚型特异性缺失Mct8/Oatp1c1不影响血清TH水平、海马TH相关基因表达、GABA/谷氨酸能系统发育、癫痫易感性、成年海马神经发生及海马依赖性行为。这提示Mct8/Oatp1c1在神经元中的功能具有高度冗余性，而其在脑屏障的转运功能缺陷才是Mct8/Oatp1c1双敲除(M/O dKO)小鼠神经异常的主要原因，为MCT8缺陷症(Allan-Herndon-Dudley syndrome, AHDS)的治疗策略提供了关键见解。

　　

甲状腺激素(TH)是大脑正常发育和功能的关键调节因子，其通过核TH受体(TRs)调控基因表达。TH进入靶细胞需要跨细胞膜的转运，其中单羧酸转运体8(MCT8)和有机阴离子转运多肽1c1(OATP1C1)是两种重要的TH特异性转运体。MCT8失活突变会导致严重的Allan-Herndon-Dudley综合征(AHDS)。在啮齿类动物中，单独敲除Mct8不足以诱导严重的神经损伤，需要联合敲除Mct8和Oatp1c1 (M/O dKO)才能模拟人MCT8缺陷的表型。M/O dKO小鼠表现出显著的脑内TH转运受损、TH浓度降低，并伴随GABA能和谷氨酸能系统的异常。然而，尚不清楚这些异常是源于中枢TH缺乏，还是Mct8和Oatp1c1在神经元中发挥细胞自主功能。

本研究首先详细描绘了Mct8和Oatp1c1在GABA能中间神经元亚群中的表达谱。利用Mct8-KO小鼠的β-半乳糖苷酶(βgal)染色作为内源性Mct8表达的替代指标，结合免疫荧光和荧光原位杂交(FISH)技术，分析了其在P12和P120小鼠海马和体感皮层中，与主要GABA能亚群标志物——小清蛋白(Pv)、生长抑素(Sst)、钙视网膜蛋白(Cr)和神经肽Y(Npy)的共表达情况。结果显示，Mct8在不同GABA能亚群中呈异质性表达，且存在时空差异。例如，在P12海马中，Cr+中间神经元共表达βgal的比例最高(63±8.5%)。FISH分析进一步证实了_Mct8mRNA在GABA能亚群中的异质性表达。相比之下，_Oatp1c1mRNA在海马Sst+神经元中仅有少量表达(2.5±0.5%)，在其他GABA能亚群中几乎不表达。

为探究Mct8/Oatp1c1在神经元中的潜在功能，研究构建了两种条件性敲除小鼠品系：在全部GABA能神经元中特异性敲除两种转运体(GABA del小鼠，使用Gad2-Cre)和在全部谷氨酸能神经元中特异性敲除(Glut del小鼠，使用Vglut2-Cre)。通过YFP报告基因染色确认了Cre重组酶在预期神经元类型中的特异性表达。

血清TH浓度与TH依赖性基因评估

在P21时，GABA del和Glut del小鼠的血清T₄、T₃、rT₃浓度与对照(CTR)小鼠无差异，而M/O dKO小鼠则表现出预期的异常TH谱。通过FISH分析下丘脑室旁核(PVN)中促甲状腺激素释放激素(_Trh)的表达，以及海马CA1区和齿状回(DG)中TH调节基因_Klf9、_Rc3和_Crym的表达，发现GABA del和Glut del小鼠与CTR小鼠无显著差异，而M/O dKO小鼠则出现明显改变。这表明神经元特异性缺失Mct8/Oatp1c1不改变全身TH稳态及神经元内的TH信号感知。

GABA能与谷氨酸能系统评估

在P12时，通过免疫荧光评估海马GABA能系统标志物，发现GABA del和Glut del小鼠的谷氨酸脱羧酶67(Gad67)蛋白表达强度，以及Pv+、Sst+、Cr+中间神经元的数量均与CTR小鼠无差异。在P120时，通过qPCR分析海马离子型谷氨酸受体亚基(NMDA、AMPA、海人酸受体)的mRNA表达，也未发现组间差异。这与M/O dKO小鼠中观察到的GABA能标志物减少和谷氨酸受体亚基表达增加形成鲜明对比。

癫痫易感性评估

通过毛果芸?碱诱导癫痫持续状态(SE)模型评估神经元兴奋性。GABA del和Glut del小鼠达到SE所需的时间与CTR小鼠相似(约70分钟)，且死亡率无差异。SE诱导12小时后，海马CA3区神经元激活标志物c-Fos和Sst的表达在两组条件敲除小鼠中也与CTR小鼠无差异。而先前研究表明，M/O dKO小鼠对毛果芸檗碱诱导的SE更敏感，潜伏期显著缩短(~40分钟)。

成年海马神经发生评估

成年海马神经发生在海马功能中至关重要。在P60小鼠的齿状回颗粒细胞下区(SGZ)，通过免疫荧光标记评估了神经发生过程的各个阶段：同时表达Sox2和胶质纤维酸性蛋白(Gfap)并具有放射状突起的神经干细胞(NSCs)、表达Tbr2的短暂扩增祖细胞(TAPs)、表达双皮质素(Dcx)的神经母细胞、共表达Dcx和Cr的未成熟神经元，以及注射EdU 28天后与神经元核抗原(NeuN)共标的成熟新生神经元。定量分析显示，GABA del和Glut del小鼠在各阶段的细胞数量均与CTR小鼠无显著差异。

海马依赖性行为评估

通过新物体识别(NOR)和高架十字迷宫(EPM)测试评估P60小鼠的学习记忆和焦虑样行为。在NOR测试中，各组小鼠的总探索时间、对新旧物体的探索时间及偏好指数均无统计学差异。在EPM测试中，GABA del和Glut del小鼠在开臂、闭臂和中心区域停留的时间与CTR小鼠无异。而M/O dKO小鼠则表现出异常，它们在开臂停留时间显著更长，在中心区停留时间更短，提示其焦虑样行为发生改变。

结论

综合以上数据，研究表明，特异性敲除GABA能或谷氨酸能神经元中的Mct8和Oatp1c1，并不影响血清TH稳态、脑内TH作用、海马GABA/谷氨酸能系统的发育、癫痫易感性、成年海马神经发生以及海马依赖性行为。这些结果强烈表明，Mct8和Oatp1c1在小鼠GABA能或谷氨酸能神经元中不发挥主要的细胞自主功能。M/O dKO小鼠中观察到的神经元异常，主要归因于其因脑屏障TH转运受损而导致的中枢性甲状腺功能减退状态。这提示，在Mct8/Oatp1c1缺失的情况下，其他TH转运体(如Mct10、Lat1或Lat2)可能足以介导TH进入神经元。本研究深化了对TH转运体功能特异性的理解，并为针对MCT8缺陷症(AHDS)的治疗策略(如专注于恢复脑屏障TH转运功能的基因治疗)提供了重要的理论依据。