《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：CTGF knockdown in Vero cells reduces autophagy and adhesion and promotes short-term suspension adaptation
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本研究针对Vero细胞悬浮培养中自噬过度和贴壁依赖性强的瓶颈，通过RNA-seq筛选发现CTGF是自噬诱导下上调的关键基因。成功构建CTGF稳定敲低细胞系，证实其能够同步抑制自噬流（LC3-II/I降低、溶酶体活性减弱）和降低细胞粘附（基质蛋白粘附率降低50%–60%），同时维持正常细胞增殖。研究发现CTGF是协调自噬与粘附功能、调控Vero细胞环境适应性的新枢纽，为克服悬浮适应瓶颈、提升疫苗生产可扩展性提供了创新的基因工程策略。
Vero细胞是源于非洲绿猴肾脏上皮细胞的重要细胞系，因其对多种病毒的易感性和非致瘤性，被广泛用于人类病毒疫苗的生产。为了满足全球疫苗日益增长的需求，生物制药行业正致力于从传统的贴壁培养系统向可规模化的无血清悬浮生产工艺转型。然而，Vero细胞固有的贴壁依赖性及其在悬浮条件下易于发生过度自噬的倾向，是实现在生物反应器中高密度、稳定生长的重大挑战。为了突破这些瓶颈，本研究通过遗传工程手段探索关键调控因子，以增强Vero细胞的悬浮培养适应性。
为精确研究自噬，研究者首先利用厄尔平衡盐溶液(EBSS)在贴壁Vero细胞中建立了饥饿诱导自噬模型。通过mCherry-GFP-LC3荧光报告系统、透射电子显微镜(TEM)以及自噬标志蛋白LC3和P62的检测，均证实EBSS可有效诱导Vero细胞发生自噬。在此基础上，对EBSS刺激1小时后的细胞进行RNA测序(RNA-seq)分析，筛选出1210个差异表达基因，其中结缔组织生长因子(CTGF/CCN2)的表达显著上调，提示其可能参与自噬过程的调控。
基于此发现，研究团队通过慢病毒介导的shRNA，成功构建了CTGF稳定敲低(敲低效率>50%)的Vero细胞系(shCTGF)。免疫荧光分析显示，敲低CTGF并未改变Vero细胞的上皮细胞特性，即细胞角蛋白-18(CK-18)正常表达，而间质细胞标志物波形蛋白(Vimentin)不表达，这保证了工程化细胞作为疫苗生产底物的安全性。
功能表征是本研究的关键。在自噬方面，Western blot分析显示，与对照细胞相比，shCTGF细胞的LC3-II/I比值显著降低，而P62表达上调，表明自噬流受损。溶酶体酸性染料LysoBrite Red和溶酶体蛋白酶组织蛋白酶B(Cathepsin B)活性探针Magic Red的检测进一步证实，CTGF敲低导致溶酶体数量减少、活性降低。透射电镜观察也直观地显示，饥饿诱导后，shCTGF细胞中自噬体和线粒体自噬的形成明显减少。这些结果共同证明，敲低CTGF能够有效抑制Vero细胞的自噬活性。
在细胞粘附与迁移方面，研究者在分别包被了I型胶原(Col I)、纤连蛋白(FN)和层粘连蛋白(LN)的细胞培养板上进行了粘附实验。结果显示，shCTGF细胞在这三种细胞外基质蛋白上的粘附率均比对照细胞降低了约50%-60%。划痕实验表明，CTGF敲低也导致细胞迁移能力轻微但持续地下降。此外，通过鬼笔环肽(phalloidin)对细胞骨架肌动蛋白(F-actin)进行染色发现，shCTGF细胞中应力纤维的丰度和结构复杂性均显著降低。这些发现揭示了CTGF在调控细胞粘附、迁移和细胞骨架重组中的关键作用。
尤为重要的是，CTGF敲低并未损害细胞的核心生理功能。生长曲线、EdU细胞增殖实验以及葡萄糖/乳酸代谢分析均表明，shCTGF细胞保持了正常的增殖能力，尽管其最大细胞密度略有降低。在饥饿应激条件下，Western blot和流式细胞术检测细胞凋亡相关蛋白（如Bcl-2、Bax、caspase-3）及细胞凋亡率，结果显示CTGF敲低并未显著影响细胞凋亡，甚至在早期应激下可能轻微缓解凋亡。这些特性对于生物工艺应用至关重要。
更令人鼓舞的是，CTGF敲低展现出对疫苗生产的潜在增益。利用水疱性口炎病毒(VSV)进行的感染实验显示，在感染后48小时，shCTGF细胞中的病毒滴度显著高于对照细胞，表明CTGF敲低促进了VSV在Vero细胞中的复制。这提示工程化细胞可能有利于提高病毒疫苗的产量。
研究的最终目标是评估CTGF敲低对Vero细胞悬浮适应性的实际影响。将细胞适应于悬浮培养后，短期（144小时）监测显示，与对照细胞相比，shCTGF细胞表现出更强的悬浮生长适应性：适应期缩短了约24小时，并且达到了更高的最大细胞密度（4.5 × 106cells/mL vs. 3.5 × 106cells/mL）。同时，在悬浮适应早期（0、12、24小时），流式细胞术检测凋亡率发现，shCTGF细胞的早期和晚期凋亡率均显著低于对照细胞，表明CTGF敲低有效降低了悬浮应激诱导的细胞凋亡，为细胞的快速适应创造了有利条件。
综上所述，本研究首次揭示了CTGF在Vero细胞中扮演着协调自噬与细胞粘附的双重调控角色。通过遗传工程手段敲低CTGF，能够同步解决悬浮培养中自噬过度和贴壁依赖性强两大核心瓶颈，从而显著增强Vero细胞的短期悬浮适应性，且不损害其增殖能力和上皮细胞特性。该研究不仅为理解CTGF在细胞环境适应性中的新功能提供了机制见解，更重要的是，所构建的CTGF敲低Vero细胞系为开发高性能的疫苗生产细胞平台提供了一种创新且具有广阔应用前景的策略，有望推动病毒疫苗规模化生产的进程。
