《Frontiers in Toxicology》：Zebrafish neuromast development: a target for endocrine disrupting chemicals?
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这篇研究性文章探讨了环境内分泌干扰物（EDCs）对斑马鱼胚胎侧线（LL）系统——一个依赖毛细胞（HCs）的神经感觉系统——发育的潜在影响。研究表明，特定EDCs（如甲状腺激素合成抑制剂甲巯咪唑和间苯二酚）在导致其他已知不良效应（如鳔未充气）的相似浓度下，即可显著减少毛细胞数量。这提示侧线毛细胞发育可作为评估EDCs神经发育毒性的一个新端点，为完善非动物测试方法提供了新思路。
引言：探索内分泌干扰物评估的新终点
面对内分泌干扰化学物对人类和环境健康影响的证据日益增多，全球范围内正在开发和实施EDCs的筛查与测试方案。理想的测试方法应能检测特定内分泌通路的扰动，同时提供生物体层面的潜在不良效应信息。目前许多评估EDCs潜在生态毒理学影响的方法，尤其是那些能够评估不良效应的，通常需要大量实验动物。在国际上减少动物测试的趋势下，利用非哺乳类脊椎动物胚胎（如鱼类和两栖类）进行化学安全评估的兴趣日益增长。在此背景下，将内分泌干扰敏感终点纳入斑马鱼胚胎测试的努力正在进行中。侧线系统的发育，作为鱼类的一种神经感觉系统，已被提议为潜在的毒理学终点。侧线系统对于猎物探测、集群行为和趋流性至关重要，它通过称为神经丘的特化结构检测水流和压力梯度。神经丘由感觉毛细胞、支持细胞和套细胞组成。毛细胞通过纤毛偏转探测水流，并将这些机械刺激转化为神经信号。鉴于EDCs与发育神经毒性之间关联的关注度不断提高，此终点显得尤为重要。已有研究在斑马鱼胚胎发育期间的神经丘中显示了三种雌激素受体基因的表达，并且外源性雌激素可有效靶向神经丘中的ERs。此外，甲状腺激素受体在斑马鱼胚胎神经丘中的组织特异性表达也已被证实。尽管将EDC暴露与毛细胞破坏及后续行为改变联系起来的研究仍然有限，但新出现的证据表明两者存在功能联系。基于现有知识表明EDCs可能干扰正常的神经丘发育，本研究进行了一项探索性研究，以评估神经丘发育是否会受到一系列具有不同作用模式的模型EDCs暴露的影响。
材料与方法
研究使用野生型斑马鱼胚胎。通过急性斑马鱼胚胎毒性测试进行EDCs筛选，暴露的化学品包括：作为阳性对照的硫酸铜、ER激动剂17α-炔雌醇、ER拮抗剂氟维司群、芳烃受体激动剂β-萘黄酮、甲状腺过氧化物酶抑制剂甲巯咪唑、同为TPO抑制剂的间苯二酚以及碘甲状腺原氨酸脱碘酶抑制剂碘帕酸。暴露基于经济合作与发展组织测试指南236进行适应性调整，包括延长暴露期（从受精后<1小时至120小时）。胚胎在28.5°C下培养。在受精后120小时，通过形态学评估死亡率、孵化情况和亚致死效应。通过将孵化后胚胎在3μM FM1-43染料中孵育45秒来标记功能性的、具有机械转导活性的毛细胞，随后在荧光显微镜下对四个特定神经丘（两个来自前侧线，两个来自后侧线）的毛细胞进行计数。为了评估甲状腺激素系统干扰的暴露时间窗口，基于甲状腺系统发育选择了三个暴露窗口（0-72 hpf， 72-120 hpf 和 0-120 hpf），并使用甲巯咪唑进行测试。此外，对暴露于500 mg/L甲巯咪唑（72-120 hpf窗口）的胚胎头部和躯体样本进行了与神经丘发育和TPO抑制相关的基因转录水平分析。所有统计分析使用R软件进行。
结果
3.1 形态学分析
暴露于硫酸铜、EE2、氟维司群、MMI、RSC和IOP的孵化后胚胎未观察到死亡率，而暴露于75和100μg/L BNF则分别导致57.5%和52.5%的死亡率。硫酸铜在三个最高测试浓度下导致鳔未充气、幼体长度减少和孵化延迟。EE2暴露未观察到形态学改变。氟维司群暴露未导致任何畸形。BNF引起多种畸形：心血管畸形、头部畸形和鳔未充气。MMI在较高测试浓度下诱导畸形，如脊柱弯曲和头部畸形，并延迟孵化、显著减少幼体长度并导致鳔未充气。RSC暴露后观察到头部畸形和鳔未充气受损。IOP暴露后观察到鳔未充气减少。
3.2 初步筛选：EDC暴露对毛细胞的影响
阳性对照硫酸铜导致毛细胞数量显著下降，验证了评估方法。EE2暴露对毛细胞数量没有任何影响。氟维司群暴露在1和2 mg/L浓度下导致毛细胞数量显著增加。BNF在两个同样导致死亡率的最高测试浓度下引起了毛细胞数量的减少。MMI暴露从240 mg/L开始导致毛细胞数量显著减少。RSC暴露也从40 mg/L开始导致毛细胞数量显著减少。IOP暴露后，仅在1 mg/L浓度下观察到毛细胞减少。对于硫酸铜和MMI，均观察到测试浓度与神经丘类型之间存在显著的交互作用。在MMI的情况下，进一步比较揭示了前侧线和后侧线之间存在显著的交互作用。
3.3 甲巯咪唑在特定时间窗口对神经丘的影响
在0-72 hpf、72-120 hpf或0-120 hpf窗口暴露于300 mg/L MMI，在四个神经丘的总和上未导致显著效应。然而，在72-120 hpf时间窗口暴露于更高浓度（500 mg/L）的MMI，在没有任何死亡率或严重畸形的情况下，导致了四个神经丘毛细胞总数量的显著减少。此外，在72-120 hpf窗口暴露于400和500 mg/L MMI后，对前侧线和后侧线的神经丘数量进行了计数。暴露于500 mg/L MMI后，在后侧线观察到神经丘数量减少。神经丘数量与幼体长度无关。
3.4 基因转录水平分析
MMI暴露（500 mg/L， 72-120 hpf）显著降低了头部样本中突触传递标志物otofb的转录水平。此外，观察到支持细胞标志物notch3和fgfr1a的转录水平显著上调，同时tpo转录本也增加。在躯体样本中，只有notch3显著上调。notch3和tpo的引物效率分别为119.81%和132.36%，这可能给倍数变化值带来了一些不确定性。
讨论
4.1 氟维司群增加了神经丘中的毛细胞数量
迄今为止，尚未直接研究EE2对毛细胞发育的影响。然而，基于ERβ2吗啉代敲低模型的数据，曾假设EE2暴露会导致毛细胞增加。但在本研究中，EE2暴露对毛细胞数量没有影响。这可能与品系敏感性差异或实际测试浓度低于名义浓度有关。相比之下，氟维司群暴露在连续暴露于1和2 mg/L后导致了有限的毛细胞增加。氟维司群作为ERα/ERβ拮抗剂和G蛋白偶联雌激素受体1激动剂发挥作用。GPER mRNA在发育中的斑马鱼胚胎神经丘中表达。在神经元系统中，GPER激活通过MAPK、CREB、cAMP和PI3K途径促进存活，这些途径对毛细胞发育和维护也至关重要。然而，先前有研究在类似浓度下观察到氟维司群导致毛细胞减少，关键区别可能在于暴露时间。本研究的暴露涵盖了从<1 hpf到5 dpf的侧线迁移和分化全过程，而其他研究在损伤后或更短的窗口期开始处理。此外，效应仅在两个（共四个）神经丘中观察到，且仅出现在中间浓度。
4.2 甲巯咪唑和间苯二酚暴露对侧线发育产生负面影响
暴露于TPO抑制剂MMI和RSC导致毛细胞数量减少，但MMI的效应在后续实验中未能完全重复，这可能归因于有限的效应大小和高变异性。在观察到毛细胞数量减少的浓度下，也观察到了鳔未充气受损（TPO抑制剂已知的短暂效应），并且从360 mg/L MMI开始还观察到了胸鳍发育受损、色素减少和颅面发育减少等已知的甲状腺激素系统干扰效应。类似地，导致毛细胞数量减少的RSC暴露也引起了鳔未充气受损和颅面发育（颌骨畸形）。综合来看，虽然甲状腺系统干扰活性在更低浓度下已被观察到，但对毛细胞的影响发生在与导致其他甲状腺系统干扰不良效应相似的浓度。毛细胞数量减少的行为后果仍未得到充分研究，但现有证据表明，例如，趋流性在化学损伤后会改变但并未完全消失。需要进一步研究，涵盖更广泛的侧线依赖性行为，以确定所观察效应的影响。
在评估甲状腺系统干扰对胚胎发育过程的影响时，必须同时考虑甲状腺系统发育和目标器官发育的时间进程。斑马鱼内源性甲状腺激素合成在60至72 hpf之间启动，早期胚胎发育主要依赖于母体传递的甲状腺激素。胚胎后侧线毛细胞的迁移在内源性甲状腺激素合成开始时已完成。由于TPO活性对甲状腺激素合成至关重要，因此TPO抑制最有可能影响晚期胚胎发生期间的毛细胞发育（而非迁移）。使用更高浓度和更短暴露窗口的后续实验导致了毛细胞数量减少。此外，后侧线的神经丘数量显著减少。目前的研究不能明确排除TPO抑制对早期胚胎发育期间毛细胞数量的潜在影响。在斑马鱼中，甲状腺激素受体与视黄酸受体之间的相互作用对于神经嵴发育至关重要，并且视黄酸信号传导已被特别涉及后侧线的形成。值得注意的是，由于过氧化物酶抑制，MMI可能导致氧化应激，这可能促成了观察到的效应。
甲状腺激素在毛细胞发育和再生中的作用在哺乳动物中已有详细描述，但在鱼类、两栖动物、鸟类和爬行动物中的可比数据仍然稀少且了解不足。目前的假设提出，甲状腺激素通过如FGF信号、Notch信号、Wnt信号和BMP信号等途径影响神经丘发育，这些途径对侧线发育至关重要，并可能受甲状腺水平调节。然而，甲状腺激素在神经丘中调节这些途径的确切机制仍不清楚。
为了更深入了解TPO抑制导致毛细胞破坏背后的机制，对毛细胞相关基因进行了转录水平分析。选择在甲状腺激素合成活跃的晚期胚胎发育期间暴露于MMI，以尽量减少一般过氧化物酶抑制的潜在非特异性效应。头部和躯体样本分别进行分析以区分前侧线和后侧线。MMI暴露后头部样本中tpo转录水平升高，可能反映了一种补偿机制，并证实了对TPO功能的影响。观察到otofb转录水平显著下降，这可能反映了用FM1-43染料测量的活性毛细胞数量减少。与支持细胞相关的notch3和fgfr1a转录水平显著上调。Fgfr1a作为非感觉侧线细胞的标志物，可能表明存在补偿毛细胞损伤的补偿途径。然而，这种上调仅在头部样本中观察到，而对毛细胞数量和神经丘的影响在后侧线观察到。Fgfr1a定位于神经丘以及大脑和咽部区域等，因此难以将观察到的效应完全归因于神经丘的变化。Notch3转录本在头部和躯体样本中均上调。损伤后必须重新启动Notch信号，以便将新分化的细胞正确分化为毛细胞和支持细胞。fgfr1a和notch3的上调表明，MMI暴露及其导致的损伤可能最终导致新毛细胞的再生和命运决定。
4.3 β-萘黄酮对毛细胞数量没有影响
芳烃受体是一个肝核受体，调节涉及细胞生长、分化和发育的基因。AhR激活可以增加肝脏清除率并降低甲状腺激素水平。在本研究中，暴露于BNF在两个最高测试浓度下减少了毛细胞数量。然而，这些浓度也引起了全身毒性。在较低浓度下未观察到毛细胞效应，这表明AhR激动并未特异性影响毛细胞发育。
结论
现有知识表明EDCs可能干扰正常的神经丘发育。这是首次探索神经丘发育是否会受到一系列具有不同作用模式的模型EDCs暴露影响的研究。暴露于MMI、RSC和氟维司群导致了毛细胞数量的改变，这些改变可在不受保护的5日龄斑马鱼胚胎中，在与其他效应报告浓度相当的浓度下观察到。硫酸铜和MMI在不同神经丘类型和侧线系统部位间引起了差异效应。这表明神经丘表现出不同的剂量-反应特征，强调了在解释侧线毒性时需要考虑神经丘特异性反应。需要注意的是，与许多其他效应类似，侧线发育受损并非ED特异性，也可能由其他机制引起。需要进一步研究，包括药理学救援实验或甲状腺通路成分的遗传调控，以阐明ED与毛细胞破坏之间的因果关系及潜在机制。本研究的局限性涉及观察到的反应存在高变异性。这种变异可能源于生物或技术差异，但它们相对贡献目前无法确定。未来研究采用更敏感或功能相关的方法，如组织学和整体原位杂交，可能为评估神经丘发育提供更高的分辨率。此外，鉴于观察到的变化幅度相对较小，需要进行行为学研究以评估所观察效应的功能相关性。
