《Frontiers in Aging》：Ginsenoside Rg1 antagonizes diabetic osteoporosis by regulating ferroptosis via mitochondrial membrane potential in H-type vascular endothelial cells
编辑推荐：
本研究发现，在糖尿病骨质疏松（DOP）中，高糖诱导H型血管内皮细胞（ECs）线粒体功能障碍，激活铁死亡（ferroptosis），导致骨代谢紊乱。人参皂苷Rg1通过调节线粒体膜电位（MMP），激活SLC3A2/SLC7A11-GPX4通路，抑制铁死亡，促进血管-成骨耦联，从而延缓DOP进展，为治疗提供了新靶点。
文章内容归纳
引言
糖尿病骨质疏松症（Diabetic Osteoporosis, DOP）是糖尿病常见的骨骼并发症，以骨量减少、骨微结构破坏、骨脆性增加为特征。流行病学数据显示，骨质疏松在2型糖尿病患者中患病率高达20%–60%。骨组织的哈弗系统高度依赖血管供应，而H型血管作为一种特殊的毛细血管亚型，其标志是能够协调血管生成与骨生成。高糖环境下内皮功能障碍被认为是DOP发生发展的关键病理过程。高糖诱导的H型血管内皮细胞损伤，包括线粒体功能障碍、脂质过氧化增加和铁死亡激活，被认为是DOP中骨丢失和骨代谢紊乱的潜在机制。
铁死亡是一种由铁代谢失调驱动的调节性细胞死亡形式，其核心机制是铁依赖性活性氧（ROS）过量产生和脂质过氧化物异常积累，导致细胞死亡。System Xc–/GSH/GPX4轴是铁死亡的主要调节通路。线粒体作为真核细胞的中心枢纽，调节铁、能量和脂质代谢，线粒体膜电位（Mitochondrial Membrane Potential, MMP）的稳定对维持线粒体相关铁死亡稳态至关重要。线粒体活性氧（mtROS）的积累与MMP密切相关，是驱动铁死亡的关键因素。
人参皂苷Rg1是人参和/或三七中的主要活性成分之一，已被证明具有抗氧化和抗骨质疏松作用，但其在DOP中的具体机制尚不完全清楚。此前研究发现Rg1可通过Notch/Noggin/VEGF通路刺激骨内H型血管和成骨细胞，促进血管-成骨耦联，从而对抗DOP进展。本研究旨在探讨Rg1是否通过其抗氧化能力调控线粒体相关铁死亡来改善DOP。
材料与方法
研究使用自发性糖尿病GK大鼠建立体内DOP模型，使用高糖处理的H型血管内皮细胞建立体外细胞模型。动物实验将GK大鼠分为模型对照组、Rg1低、中、高剂量组，并设置空白对照组（Wistar大鼠）。通过12周灌胃给药，利用微计算机断层扫描（micro-CT）分析骨矿物质密度（BMD）和骨微结构参数，以筛选最有效的Rg1剂量。为探讨机制，另设Rg1组、铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）组、铁死亡激活剂RSL3组及联合治疗组。通过免疫荧光检测成骨标志物Osterix及H型血管标志物CD31和Emcn的表达。通过检测骨组织中谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）含量，以及RT-qPCR和Western blot分析SLC3A2、SLC7A11、GPX4的mRNA和蛋白表达，评估铁死亡状态。
细胞实验使用原代大鼠股骨头微血管内皮细胞（H型ECs），通过免疫荧光鉴定CD31和Emcn共表达以确认细胞类型。通过MTT法确定Rg1干预的最佳浓度和时间。将细胞分为正常糖对照组（CON）、高糖组（HG）和高糖+Rg1组（HG+Rg1）。通过流式细胞术检测脂质过氧化水平（BODIPY 581/591 C11染色）和线粒体膜电位（JC-1染色），通过荧光显微镜观察线粒体活性氧（mtROS，MitoSOX? Red染色）。通过siRNA敲低GPX4基因，并利用线粒体解偶联剂羰基氰化物间氯苯腙（CCCP）干预，探讨MMP、mtROS与GPX4通路之间的关联。
结果
Rg1改善DOP大鼠骨微结构
与Wistar大鼠相比，GK大鼠表现出持续高血糖和严重的骨丢失，表现为BMD、骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）和厚度（Tb.Th）显著降低，骨小梁分离度（Tb.Sp）和结构模型指数（SMI）增加，成功诱导DOP模型。Rg1治疗后，骨丢失显著缓解，中、高剂量Rg1效果相当。H&E染色显示Rg1可剂量依赖性地改善骨组织的病理改变，如骨小梁数量减少、断裂、排列紊乱等。
Rg1促进成骨及H型血管形成
免疫荧光显示，Rg1与铁死亡抑制剂Fer-1在促进成骨标志物Osterix表达方面效果相似，且Rg1可逆转铁死亡激活剂RSL3对成骨的抑制作用。同时，RSL3抑制了H型血管标志物CD31和Emcn的表达，而Rg1部分逆转了RSL3对H型血管形成的抑制。
Rg1抑制DOP大鼠铁死亡
Rg1与Fer-1在提升骨组织GSH水平方面无显著差异，但Rg1显著降低了MDA水平。Rg1和Fer-1组中SLC3A2、SLC7A11和GPX4的mRNA和蛋白表达水平相当，且Rg1逆转了RSL3诱导的这些基因的下调。表明Rg1可恢复抗氧化能力，减少脂质过氧化，抑制DOP大鼠的铁死亡。
Rg1抑制H型ECs铁死亡
细胞实验确认了培养的细胞为CD31和Emcn双阳性的H型ECs。MTT实验确定164.8 μmol/L Rg1作用48小时为最佳干预条件。高糖处理降低了H型ECs的GSH水平，增加了脂质过氧化和mtROS水平，并下调了SLC7A11、SLC3A2和GPX4的mRNA及蛋白表达。Rg1处理可逆转高糖诱导的上述所有变化。
Rg1通过调节MMP抑制H型ECs铁死亡
高糖处理导致H型ECs的MMP升高、mtROS积累和GPX4表达降低。线粒体解偶联剂CCCP处理降低了MMP和mtROS水平，但未显著改变GPX4蛋白表达。Rg1处理同样降低了MMP和mtROS，并上调了GPX4表达。Rg1与CCCP联合处理效果更强，表明Rg1可能通过抑制MMP和mtROS积累，同时上调GPX4表达来抑制H型ECs的铁死亡。
Rg1通过调节GPX4减轻铁死亡
通过siRNA敲低GPX4后，即使在高糖条件下，Rg1处理仍能显著降低mtROS水平。这表明Rg1减轻mtROS产生、缓解铁死亡的作用，并不完全依赖于GPX4通路，可能涉及其他调控机制。
讨论
本研究证实，H型ECs的铁死亡是DOP进展的关键驱动因素。Rg1通过多靶点作用对抗这一病理过程。在机制上，Rg1一方面激活了SLC3A2/SLC7A11-GPX4这一核心抗铁死亡通路，提升细胞抗氧化能力，减少脂质过氧化产物积累。另一方面，Rg1调控了线粒体功能的关键指标——线粒体膜电位。高糖导致的MMP异常升高会驱动mtROS过量生成，而Rg1能够降低MMP，减少mtROS，从而从源头遏制铁死亡的启动因素。尽管Rg1可同时调节MMP和GPX4表达，但现有证据尚不足以确定MMP变化是GPX4调控的上游原因，二者可能是在Rg1干预下平行或协同被调节的。此外，即使在GPX4被敲低的情况下，Rg1仍能降低mtROS，提示其线粒体保护作用可能还涉及激活Nrf2等其他抗氧化防御通路或改善线粒体质量控制系统（如线粒体自噬）等独立于GPX4的机制，这有待未来研究进一步阐明。
结论
本研究发现，人参皂苷Rg1能够通过调节H型血管内皮细胞的线粒体膜电位，减少线粒体活性氧积累，并激活SLC3A2/SLC7A11-GPX4信号通路，从而有效抑制铁死亡。这一多靶点作用最终促进了骨骼中的血管-成骨耦联，调节骨代谢，延缓了糖尿病骨质疏松症的进展。该研究不仅揭示了铁死亡在DOP中的关键作用，也为将Rg1开发为通过靶向线粒体-铁死亡轴治疗DOP的潜在药物提供了新的理论依据和实验支持。
