《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：An amplicon-based tiled PCR scheme for the enrichment of avian metapneumovirus subtype B genomes prior to next generation sequencing
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本研究报道了一种新型的禽偏肺病毒B亚型（aMPV-B）扩增子瓦片式PCR（aMPVB-ATP）基因组富集方案，旨在解决当前美国aMPV疫情中病毒全基因组测序（WGS）的难题。文章通过与宿主核糖体RNA耗竭结合序列非依赖性单引物扩增（HD-SISPA）的传统方法进行对比，证明aMPVB-ATP方案在提高测序数据中病毒读段比例、基因组覆盖度及测序深度方面具有显著优势，为快速获取高质量aMPV-B基因组、支持分子流行病学调查和精准防控提供了高效、通用的技术工具。
引言：禽偏肺病毒的再度暴发与基因组测序需求
禽偏肺病毒（aMPV）是禽类重要的呼吸道病原体。美国在21世纪初清除C亚型后长期无aMPV，但在2023-2024年间，A和B亚型再度出现，并迅速扩散至超过30个州，造成了严重的经济损失。全基因组测序（WGS）已成为病毒表征和流行病学调查的关键工具，然而，临床样本中宿主核酸占主导，直接测序常导致病毒基因组数据不足。因此，在测序前对病毒基因组进行富集至关重要。目前已有多种方法，如宿主RNA耗竭、序列非依赖性单引物扩增（SISPA）和探针杂交等。本研究旨在开发并测试一种针对aMPV-B的新型扩增子瓦片式PCR（aMPVB-ATP）富集方案，以提高测序灵敏度。
材料与方法
研究使用了美国乔治亚州鸡群中采集的10份aMPV-B阳性口咽拭子样本。首先通过RT-qPCR确定样本的循环阈值（Ct）。研究比较了两种富集策略：目前使用的宿主/细菌RNA耗竭结合SISPA（HD-SISPA）方法，以及新开发的aMPVB-ATP方案。aMPVB-ATP方案基于aMPV-B参考基因组（匈牙利/657/4株，NCBI登录号MN729604.1）设计了五对引物，产生长度在3,075至3,751 bp之间、最小重叠为83 bp的五个扩增子，以覆盖全基因组。此外，还尝试了使用首尾引物进行长片段PCR以一次性扩增完整基因组。富集后的产物分别使用Illumina短读长和Oxford Nanopore Technologies（ONT）长读长平台进行测序，并通过生物信息学分析比较病毒读段比例、基因组覆盖度和测序深度。
结果
1. aMPVB-ATP方案的开发与验证
基于64个aMPV-B基因组的硅内验证表明，所设计的引物与美国流行株匹配良好，与国际毒株的错配也极少，表明该方案适用于广泛的aMPV-B分离株。在10份Ct值介于14至33的样本中测试该方案。琼脂糖凝胶电泳显示，Ct值<18的样本可观察到所有预期条带。Illumina测序结果显示，对于Ct值≤22的样本，平均78%的高质量读段为aMPV-B比对读段，并获得了覆盖度>99%、测序深度>2,300X的完整或近乎完整的基因组。随着Ct值升高，病毒读段比例、基因组覆盖度和测序深度均急剧下降。例如，Ct值为25、28和31的样本，其aMPV-B比对读段比例分别降至13%、1.6%和0.01%。此外，在测序深度较好的样本中，观察到从基因组5‘端到3’端的读段数有轻微下降。
2. aMPVB-ATP方案显著优于HD-SISPA
与HD-SISPA方法相比，aMPVB-ATP方案产生了显著更高比例的aMPV读段。具体而言，aMPVB-ATP处理样本的aMPV读段比例中位数为41%，而HD-SISPA仅为1%。同样，aMPVB-ATP在基因组覆盖百分比和测序深度方面也显著优于HD-SISPA。这些结果证明，对于从呼吸道样本中富集aMPV-B基因组，aMPVB-ATP是一种更高效的方法。
3. aMPVB-ATP方案与长短读长测序平台的兼容性
aMPVB-ATP扩增子也使用ONT长读长平台进行了测序。对于Ct值<24的样本，ONT测序产生了高比例的aMPV-B比对读段（平均89%），并获得了完整的基因组覆盖。与Illumina结果一致，从5‘端到3’端的读段覆盖也存在轻微下降趋势。对于Ct值≤22的样本，将aMPVB-ATP结合Illumina与结合ONT生成的基因组进行比对，显示核苷酸序列相似性>99.7%，表明不同测序平台产生的组裝结果高度一致。使用单一长片段PCR引物对进行全基因组扩增的尝试，仅对Ct值≤24的样本成功，且产生的病毒读段比例和长度均低于瓦片式PCR方案。
讨论
病毒暴发期间的基因组数据对于疫情应对和长期控制至关重要。美国当前的aMPV疫情缺乏足够的基因组数据，部分原因在于难以直接从临床样本获取完整的aMPV基因组。传统的病毒分离培养方法对aMPV效果不佳，且可能引入适应性突变。本研究的aMPVB-ATP方案允许直接从临床样本（如口咽拭子）进行测序，相比HD-SISPA等其他分子富集方法，能从更高Ct值（即病毒载量更低）的样本中获取更多完整基因组。
该方案的另一优势是与ONT长读长测序兼容，且无需繁琐的酶学耗竭步骤，为资源有限的实验室提供了更经济的选择。虽然ONT测序本身存在较高的单碱基错误率，但其与aMPVB-ATP结合后，似乎能从更高Ct值的样本中恢复更多完整基因组。若需要进行高分辨率的单核苷酸多态性（SNP）分析，建议在aMPVB-ATP富集后增加Illumina测序深度，或构建Illumina与ONT数据的混合组装以提高共识序列的准确性。
本研究的局限性在于仅使用了来自乔治亚州的10份样本进行测试，其在不同样本中的广泛性能有待进一步验证。尽管硅内验证显示引物设计稳健，但由于扩增子方法依赖于引物与模板的互补性，持续的基因组监测和必要时对引物结合区的重新评估仍然重要。最后，考虑到美国疫情中aMPV-A和B亚型共循环，未来可基于相同的设计原则，利用美国aMPV-A的基因组数据，开发A亚型特异性的瓦片式PCR方案，从而建立一个能够应对多亚型暴发的统一基因组监测框架。
总之，aMPVB-ATP是一种新颖且高效的基因组富集方法，与NGS结合，能以高测序深度恢复完整的aMPV-B基因组。其与短读长（Illumina）和长读长（ONT）测序技术的兼容性，使其具有易于扩展的 versatility，为aMPV疫情的实时分子流行病学研究提供了有力的技术支持。
