《Frontiers in Plant Science》：Effects of saturation flash protocols on photosynthetic induction and assessment of mesophyll conductance and maximum carboxylation rate sensitivity to parameter inputs in Ficus carica
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本研究以无花果为材料，探究了叶绿素荧光测量中应用的饱和闪光是否干扰光合诱导过程，并系统评估了叶肉导度和最大羧化速率对关键参数（如叶片吸光系数、CO2补偿点等）变化的敏感性。结果表明，饱和闪光不会影响光合诱导动力学，这为在动态光条件下应用荧光技术估算叶肉导度提供了方法学基础。敏感性分析揭示了参数选择对估算叶肉导度和最大羧化速率的重要性，而光合限制分析则明确了在无花果中，气孔限制是光合诱导期的主要限制因子。本研究为理解动态光下光合效率的限制机制及优化测量方法提供了新的理论依据。
饱和闪光协议对光合诱导的影响及叶肉导度与最大羧化速率对参数输入的敏感性评估
引言
在自然环境中，光照强度不断波动，这使得稳态条件下的光合性状不足以表征实际的光合表现。在从低光到高光的转变过程中，光合速率通过一个称为光合诱导的过程逐渐上升。由于该过程固有的延迟，突然高光下的瞬时光合效率低于相同辐照度下可达到的稳态效率，据报道损失高达21%。因此，提高诱导阶段的光合效率，特别是通过加速达到稳态，是提高整体植物生产力的一种有前景的策略。
当前机制理解表明，从低光到高光转变后的光合诱导受三个主要过程调控：类囊体膜中光合电子传递的诱导动力学、卡尔文-本森循环酶（尤其是Rubisco）的激活，以及沿着叶绿体途径的CO2扩散。其中，CO2扩散途径包括两个连续的导度：通过气孔从叶表面扩散到细胞间隙的气孔导度，以及从细胞间隙扩散到叶绿体基质的叶肉导度。过去十年的大量研究集中在气孔动力学及其对光合诱导的影响上，而叶肉导度传统上被认为是次要限制因素。然而，来自稳定同位素方法的最新证据表明，叶肉导度可以对光合诱导施加相当大的限制，贡献高达总限制的约35%。因此，识别光合诱导期间的关键限制因素对于提高光合效率至关重要。
量化叶肉导度的动态变化已被证明对于准确的限制分析至关重要，因为忽略叶肉导度动态可能导致对主导限制过程的错误识别。尽管稳定同位素方法提供了对叶肉导度的可靠估计，但它们需要昂贵的激光光谱仪、复杂的测量程序和大量的理论知识。因此，许多研究采用基于叶绿素荧光的技术作为替代。然而，这些方法经常忽视一个基本前提：荧光测量期间使用的饱和多相闪光是否影响叶片的光合诱导状态。在基于荧光的方法能够定量应用之前，这种验证是必不可少的。此外，叶肉导度的计算依赖于几个参数，包括电子传递速率和存在线粒体呼吸时的CO2补偿点，这些参数通常被视为固定值，而不是通过经验确定。这种简化在稳态条件下已经被认为是不合适的，需要进行参数校准。因此，在诱导期间进行参数校准，结合敏感性分析，迫切需要阐明参数变异性如何影响叶肉导度的估计。
材料与方法
本研究以无花果幼苗为材料。为了检查荧光测量期间饱和闪光对光合诱导过程的影响，采用了以下实验设计：最初使用不施加饱和闪光的LI-6800系统进行光合诱导期间的气体交换测量。为了避免潜在的顺序或驯化效应，在同一组叶片上进行了有和无饱和闪光的光合诱导测量。测量在3月于周口师范学院进行。通过测量净光合速率和气孔导度等参数，并使用荧光叶室测量稳态荧光和最大荧光等荧光参数，来评估闪光的影响。利用这些荧光数据，根据公式计算光系统II的量子效率，并确定通过光系统II的线性电子传递速率。叶肉导度则根据可变的电子传递速率方法进行计算，其关系式考虑了净光合速率、细胞间CO2浓度、存在线粒体呼吸时的CO2补偿点以及线粒体呼吸速率等参数。CO2补偿点和线粒体呼吸速率通过Laisk方法确定。
为了量化光合诱导期间的限制，总光合速率与其稳态值的偏差主要受生化、叶肉导度和气孔导度因素的影响，可表达为各限制分量贡献之和。其中，生化限制贡献可进一步表达为净光合速率对最大羧化速率的偏导数与最大羧化速率实时值与稳态值之差的乘积。叶肉导度和气孔限制贡献的表达形式类似，分别为净光合速率对各导度的偏导数与对应导度实时值与稳态值之差的乘积。Rubisco限制的净光合速率可以用Michaelis-Menten方程表达，结合CO2扩散方程，可以求解出净光合速率对最大羧化速率、叶肉导度和气孔导度的偏导数。在任何时间点，最大羧化速率的值可以根据净光合速率、叶绿体CO2浓度、CO2补偿点、线粒体呼吸速率和Rubisco的米氏常数计算得出。在整个光合诱导过程中，对最大羧化速率、叶肉导度和气孔导度的相对限制计算为各自项的时间积分。
本研究还进行了敏感性分析，以确定参数变化如何影响叶肉导度、最大羧化速率的估计以及光合限制值。具体而言，基于测量值，将叶片吸光系数与光量子分配比例的乘积以及CO2补偿点变化±10%，以评估它们对叶肉导度的影响。由于叶肉导度的变化会导致叶绿体CO2浓度的变化，进而影响最大羧化速率的计算，因此也评估了这些参数变化如何影响最大羧化速率。此外，用于最大羧化速率计算的Rubisco亲和常数在之前的光合诱导研究中通常是固定的，本研究同样将其变化±10%以检查其对最大羧化速率的影响。鉴于叶肉导度和最大羧化速率的变化会影响光合限制值的计算，我们分析了这三个参数的变化对光合限制的影响。
结果
同化作用和气孔诱导动力学（有/无饱和闪光）
研究结果显示，在从低光到高光转变过程中，无论是否施加荧光闪光，无花果的净光合速率都逐步增加并达到稳态。由于光合作用在诱导阶段是逐步而非瞬时增加的，由此产生的延迟导致潜在碳同化相对于光合速率立即达到其稳态的理想化条件减少了11.3%。同样，气孔导度在两种处理的光合诱导过程中也表现出逐渐增加，直到达到稳定水平。为了评估饱和闪光是否影响光合诱导过程，我们比较了低光下的净光合速率和气孔导度初值，高光下的终值，以及它们的响应速度。结果表明，在有无饱和闪光处理下，CO2同化和气孔导度在诱导期间的时间动态高度可比。具体而言，低光下的净光合速率初值分别为2.55和2.68 μmol m-2s-1。高光下的净光合速率终值达到7.91和7.39 μmol m-2s-1，而达到最大净光合速率90%所需的时间分别为12.5和11.3分钟。气孔导度也观察到类似的模式：低光下的初值分别为0.032和0.031 mol m-2s-1，高光下的终值分别为0.090和0.077 mol m-2s-1，达到气孔导度稳态值90%所需的时间分别为10.1和9.5分钟。统计分析显示，这六个参数中的任何一个都没有显著差异，证明荧光测量中使用的饱和闪光没有改变光合诱导过程。此外，无花果中净光合速率和气孔导度的时间轨迹显示出显著的一致性，它们几乎同步地向稳态发展，表明在诱导期间碳同化和气孔行为进行了协调调整。
光合诱导期间叶肉导度和最大羧化速率的参数依赖性变化
研究证实饱和闪光不影响光合诱导过程，这为应用叶绿素荧光方法估算叶肉导度建立了一个必要前提。在此前提下，我们进行了第二步，即关于叶肉导度计算的参数校正要求。结果显示，当使用测量的吸光系数与光量子分配比例乘积值以及CO2补偿点计算叶肉导度时，无花果在低光下表现出0.0284 mol m-2s-1的导度。在光合诱导过程中，叶肉导度逐渐增加，最终稳定在0.067 mol m-2s-1。最大羧化速率表现出类似的模式，从低光下的20.5 μmol m-2s-1上升到稳态时的75.7 μmol m-2s-1。
敏感性分析表明，吸光系数与光量子分配比例乘积值以及CO2补偿点的变化显著影响叶肉导度估计。当吸光系数与光量子分配比例乘积值降至其测量值的90%时，估计的叶肉导度高于实际值，在低光下增加了62.9%，在高光下平均增加了20.1%。相反，将吸光系数与光量子分配比例乘积值增加到110%导致叶肉导度被低估，在低光下减少了18.9%，在高光下减少了10.2%。CO2补偿点的变化产生了相反的效果。将CO2补偿点降至其测量值的90%导致叶肉导度被低估，在低光下减少了15.9%，在高光下平均减少了10.5%。将CO2补偿点增加到110%导致叶肉导度高估，在低光下增加了24.2%，在高光下增加了13.4%。这些结果共同表明，与高光下相比，叶肉导度估计在低光下对参数变化更敏感。
由于最大羧化速率取决于叶绿体CO2浓度，而叶肉导度的变化会改变叶绿体CO2浓度，因此吸光系数与光量子分配比例乘积值以及CO2补偿点的变化也间接影响了最大羧化速率。当吸光系数与光量子分配比例乘积值降至90%时，最大羧化速率在低光下减少了16.8%，在高光下减少了14.5%。将吸光系数与光量子分配比例乘积值增加到110%导致最大羧化速率被高估，在低光下增加了20.8%，在高光下增加了2.3%。相反，将CO2补偿点降至90%导致最大羧化速率被高估，在低光下增加了8.5%，在高光下增加了9.1%，而将CO2补偿点增加到110%导致最大羧化速率被低估，在低光下减少了7.0%，在高光下减少了17.8%。
除了叶肉导度和最大羧化速率对吸光系数与光量子分配比例乘积值以及CO2补偿点变化的敏感性外，我们还评估了Rubisco亲和常数对最大羧化速率估计的影响。结果表明，Rubisco亲和常数的变化影响相对较小。当Rubisco亲和常数降至其测量值的90%或增加到110%时，最大羧化速率的变化约为8.2%。这个影响大小明显小于吸光系数与光量子分配比例乘积值以及CO2补偿点的影响，表明Rubisco亲和常数的不确定性对光合诱导期间最大羧化速率的总体变异性贡献较小。
吸光系数与光量子分配比例乘积、CO2补偿点和Rubisco亲和常数变化对光合限制分配的影响
基于光合诱导期间净光合速率、气孔导度、叶肉导度和最大羧化速率的变化，我们量化了每个限制成分的相对贡献。气孔限制、叶肉导度限制和生化限制分别占总限制的41.4%、30.9%和27.7%。这些值表明，气孔限制是无花果光合诱导的主要限制，尽管它与叶肉导度限制在统计上无显著差异。
我们随后评估了吸光系数与光量子分配比例乘积、CO2补偿点和Rubisco亲和常数的变化对限制分配的影响。当吸光系数与光量子分配比例乘积降至其测量值的90%时，气孔限制和叶肉导度限制分别减少了9.5%和2.1%，而生化限制增加了17.7%。将吸光系数与光量子分配比例乘积增加到110%产生了相反的模式，气孔限制和叶肉导度限制分别增加了6.2%和3.9%，同时生化限制减少了13.9%。将CO2补偿点降至其测量值的90%使气孔限制和叶肉导度限制分别增加了2.9%和5.9%，而生化限制减少了11.2%。相反，将CO2补偿点增加到110%导致气孔限制和叶肉导度限制分别减少了1.5%和3.9%，相应地生化限制增加了7.3%。尽管这些参数调整改变了个别限制成分的数值，但统计分析显示，与使用观测参数值计算的结果相比没有显著差异。相比之下，改变Rubisco亲和常数的影响可以忽略不计，因为气孔限制、叶肉导度限制和生化限制基本保持不变。综上所述，这些发现表明，吸光系数与光量子分配比例乘积、CO2补偿点和Rubisco亲和常数的变化不会改变无花果在光合诱导期间的整体限制模式。
讨论
饱和闪光对光合诱导的影响
量化光合诱导期间叶肉导度的实时动态对于阐明波动光下光合效率的调控机制至关重要。近年来，基于叶绿素荧光的方法越来越多地用于估计诱导期间的叶肉导度。这种方法的扩展主要是由于人们日益认识到叶肉导度是诱导期间光合效率的一个关键限制。因此，准确捕捉叶肉导度动力学对于理解实际条件下整个植物的生产力和碳收益至关重要。然而，荧光测量期间施加的饱和闪光强度通常高达约8000 μmol m-2s-1，这引发了它们可能扰乱叶片的光合状态从而改变光合诱导自然过程的担忧。因此，有必要确定这些闪光是否影响生理诱导过程。我们的结果表明，关键光合参数在有无饱和闪光处理之间没有表现出显著差异，表明闪光不会明显影响内在的诱导动态。这种无干扰性尤为重要，因为饱和闪光在短时间内被重复使用，任何光抑制或调节副作用否则会在诱导期间累积。因此，净光合速率和气孔导度在处理之间的趋同为荧光技术与瞬态测量兼容提供了强有力的证据。这些发现表明，叶绿素荧光技术在方法学上适用于在光合诱导期间实时监测叶肉导度。因此，研究人员可以放心地在波动光研究中采用基于荧光的叶肉导度估计，而无需担心测量引起的人为效应。尽管不显著，但与普通气体交换测量相比，饱和闪光确实高估了净光合速率和气孔导度。未来的研究可以收集更多数据来分析有和无饱和闪光时光合参数的经验关系，从而进行潜在的校准，从而提高基于荧光的叶肉导度估计的可靠性。
气孔限制在无花果光合诱导期间作为主要限制的主导地位
在确认基于荧光的方法基本可靠的基础上，我们使用从叶绿素荧光和气体交换联合测量获得的净光合速率、气孔导度、叶肉导度和最大羧化速率进行了光合限制分析。我们的结果表明，光合诱导导致碳损失11.3%。这种损失低于之前几项研究报告的水平，这可能归因于诱导期间净光合速率和气孔导度响应相对同步，这反映在达到90%稳态值的时间相似上。这种同步表明，与许多其他物种相比，无花果中叶肉和气孔过程在更大程度上是共同调控的，在其他物种中，延迟的气孔开放通常对CO2扩散造成重大瓶颈。时间积分限制分析进一步揭示，在无花果的诱导期间，气孔导度是主要的限制因素。先前的研究表明，物种或处理之间气孔限制的差异通常与气孔响应时间的差异有关——较慢的响应通常导致更强的气孔限制。此外，气孔导度从低光到高光转变的幅度也会影响气孔限制的程度，这与我们的发现一致。在低光下气孔导度保持极低的物种中，高光转变后大规模开放的需求加剧了气孔限制的持续时间和幅度。无花果通过相对于高光条件，在低光下保持中等较高的气孔导度，部分避免了这种情况，减少了诱导负担，并可能解释观察到的较低碳损失。然而，即使有这种适应，气孔限制仍然是主导因素，突显了优化气孔动力学对于提高该物种在波动光下的光合效率的潜力。
