葡萄叶片苯丙烷代谢物基于生理与转录组分析在霜霉病抗性中的核心防御作用解析

《Frontiers in Microbiology》：Phenylpropanoid metabolites from grape leaves contribute to strong defense roles against downy mildew based on physiological and transcriptomic analyses

本文结合生理与转录组学分析，系统阐明了葡萄叶片苯丙烷代谢物（如木质素、总酚、类黄酮等）在抗霜霉病（Plasmopara viticola）中的关键防御功能。通过对比抗病品种Moldova与感病品种Red Globe，研究发现抗病品种能更快速、更显著地积累苯丙烷代谢物，并激活苯丙烷代谢通路（phenylpropanoid biosynthesis）、类黄酮生物合成通路（flavonoid biosynthesis）以及芪类化合物（stilbenoid）合成通路中关键基因（如VvCAD、VvCCoAOMT、VvCHS、VvSTS等）的表达。该研究为筛选葡萄抗霜霉病育种的关键靶基因（target genes）及解析病原互作机制提供了重要理论依据。

　　

材料与方法

研究选取抗霜霉病葡萄品种Moldova与感病品种Red Globe，在2025年4月于国家种质资源太谷葡萄圃采集健康叶片。供试病原菌为Plasmopara viticola菌株GX5-12。将叶片制成直径1.5 cm的叶盘，用浓度为1×10⁵sporangia·mL^?1的孢子悬浮液接种，以未接种叶盘为对照。分别于接种后0小时、1天（1 dpi）和5天（5 dpi）取样，用于生理指标测定和转录组测序。

病害指数依据葡萄霜霉病叶片分级标准计算。生理指标测定包括：采用紫外分光光度法测定叶绿酸、木质素、总酚和类黄酮含量；通过硫代巴比妥酸（TBA）法测定丙二醛（MDA）含量；以愈创木酚为底物测定过氧化物酶（POD）活性，以邻苯二酚为底物测定多酚氧化酶（PPO）活性。

转录组测序在Illumina NovaSeq 6000平台上进行，获得双端150 bp（PE150）读数。原始数据经fastp质控后，使用HISAT2比对到葡萄参考基因组（Vitis vinifera, Ensembl release-52）。基因表达量以FPKM值表示，利用DESeq2筛选差异表达基因（DEGs），筛选标准为|log₂Fold Change| ≥ 1且错误发现率（FDR）< 0.05。对DEGs进行基因本体（GO）功能注释和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。随机选择10个DEGs进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证，以VvActin1为内参基因。

结果

接种后叶片表型变化

接种5天后，感病品种Red Globe叶片接种点密布白色棉絮状菌丝体，而抗病品种Moldova叶片仅见稀疏白色菌丝，接种点无明显菌丝生长。病害指数分析显示，Moldova的病害指数为4.75，Red Globe为63.90，表明Moldova为高抗（HR）品种，Red Globe为高感（HS）品种。

次生代谢物含量变化

抗病品种Moldova在接种后1 dpi和5 dpi，其叶片中类黄酮、绿原酸和总酚含量均显著高于感病品种Red Globe。木质素含量在5 dpi时，Red Globe略高于Moldova。这些结果表明苯丙烷代谢物在葡萄防御霜霉病侵染中扮演重要角色。

抗氧化酶活性与MDA含量

在接种后5 dpi，抗病品种Moldova的PPO和POD活性均显著高于Red Globe。MDA含量在Moldova中始终低于Red Globe，表明抗病品种细胞膜受损程度更轻。

转录组数据概览

转录组测序各样本清洁数据量均超过6 Gb，Q30碱基百分比≥92%。主成分分析（PCA）显示不同品种及不同接种时间点样本明显分离，生物学重复性好。维恩图分析显示四个比较组（M1_vs_M0, M5_vs_M0, R1_vs_R0, R5_vs_R0）共有1565个共同DEGs。各比较组DEGs数量分别为：M1_vs_M0组7852个（上调4078，下调3774），M5_vs_M0组7170个（上调3369，下调3801），R1_vs_R0组6838个（上调3764，下调3066），R5_vs_R0组6830个（上调3632，下调3206）。qRT-PCR验证结果显示，随机选择的10个基因的表达变化趋势与RNA-seq数据高度一致（R²> 0.9667）。

DEGs功能注释与分类

GO富集分析显示，DEGs显著富集于代谢过程（metabolic process）、细胞过程（cellular process）、对刺激的反应（response to stimulus）、催化活性（catalytic activity）等功能类别。KEGG通路富集分析共将1359个DEGs映射到129条通路，其中显著富集（P ≤ 0.05）的前10条通路包括：植物激素信号转导（plant hormone signal transduction）、苯丙烷生物合成（phenylpropanoid biosynthesis）、类黄酮生物合成（flavonoid biosynthesis）、芪类/二芳基庚烷类/姜辣素生物合成（stilbenoid, diarylheptanoid, and gingerol biosynthesis）等。

植物激素信号转导通路相关DEGs

共鉴定出62个与植物激素信号转导通路相关的DEGs。其中，病程相关蛋白1基因（VvPR1, VIT_03s0097g00700）在Moldova的5 dpi显著上调，而在Red Globe中持续下调。茉莉酸-酰胺合成酶基因VvJAR1（VIT_12s0059g01870）在两个品种接种后均上调。乙烯响应转录因子VIT_05s0049g0051在Moldova中上调，在Red Globe中下调。脱落酸信号传感器基因VvSUC11（VIT_05s0077g01550）和生长素受体基因VvTIR1（VIT_07s0104g01320）在Moldova中持续上调。

苯丙烷代谢相关DEGs

共鉴定出27个苯丙烷代谢通路相关DEGs。在抗病品种Moldova中，接种后1 dpi即有多个基因显著上调，如编码肉桂醇脱氢酶（CAD）的VIT_03s0180g00260和编码咖啡酰-CoA O-甲基转移酶（CCoAOMT）的VIT_07s0031g00350。此外，多个过氧化物酶编码基因（如VIT_08s0040g02200）在Moldova的1 dpi显著上调。

类黄酮生物合成通路相关DEGs

共鉴定出24个类黄酮生物合成通路相关DEGs。查尔酮合成酶基因（VvCHS, VIT_14s0068g00930）在Moldova中持续显著上调（1 dpi上调4.2倍，5 dpi上调12.9倍），而在Red Globe中后期下调。黄烷酮3-羟化酶基因（VvF3H, VIT_18s0001g03470）和二氢黄酮醇4-还原酶基因（VvDFR, VIT_15s0048g01000）在Moldova中也被强烈诱导，在Red Globe中诱导较弱或延迟。

芪类化合物生物合成通路相关DEGs

共鉴定出16个芪类化合物生物合成通路相关DEGs。芪合酶基因（STS, VIT_16s0100g01100）在Moldova中特异性强烈诱导（1 dpi上调3.25倍，5 dpi上调4.38倍），而在Red Globe中1 dpi被抑制。白藜芦醇O-甲基转移酶基因（ROMT, VIT_12s0028g01880）在Moldova中诱导更早、更高效。

讨论

葡萄霜霉病的日益严重对全球葡萄生产造成重大损失。本研究发现，抗病品种Moldova在接种霜霉菌后，能更快速、更大量地积累苯丙烷次生代谢物（类黄酮、绿原酸、总酚、木质素），这些代谢物在抵御病原菌侵染中发挥核心防御作用。木质素的早期大量积累有助于在侵染点快速构建物理屏障。同时，抗病品种表现出更高且持续的PPO和POD活性，能有效清除病原侵染诱导的活性氧（ROS），减轻氧化损伤。较低的MDA含量表明其细胞膜系统受损更轻，为防御反应的执行提供了结构基础。

转录组分析揭示，抗病品种能更有效地激活包括水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）、乙烯（ET）、脱落酸（ABA）和生长素在内的多重植物激素信号通路，形成协同调控网络。更重要的是，抗病品种能同时强力诱导苯丙烷代谢通路的不同分支，即协同增强木质素合成（物理防御）和芪类化合物（如白藜芦醇）合成（化学防御），构建了多层次、综合性的防御体系。苯丙烷代谢通路、类黄酮生物合成通路以及芪类化合物合成通路中关键基因（如VvCAD、VvCCoAOMT、VvCHS、VvF3H、VvSTS等）的显著上调，是抗病品种展现强大防御能力的关键分子基础。

结论

本研究通过对比抗霜霉病与感病葡萄品种在接种Plasmopara viticola前后苯丙烷代谢物含量变化及转录组基因表达差异，发现病原侵染能诱导苯丙烷代谢通路中木质素生物合成、芪合酶（STS）生物合成及相关调控基因的表达，且在抗病材料中的表达水平显著高于感病材料。这些发现为筛选葡萄抗霜霉病育种的核心防御基因（candidate target genes）及解析病原与寄主互作机制提供了重要的理论基础和基因资源。