《Frontiers in Microbiology》：Genomic characterization and pathogenicity assessment of a novel strain of duck reovirus identified in China
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这篇综述（研究文章）系统表征了在中国山东分离到的一株新型鸭呼肠孤病毒（Novel Duck Reovirus, NDRV）毒株SD416。文章通过全基因组测序、体外细胞学实验及雏鸭攻毒模型，揭示了SD416独特的基因组结构、显著的年龄依赖性致病力（即1日龄鸭高死亡，7/14日龄鸭仅脾脏病变），并鉴定出其与已知中国鸭呼肠孤病毒株，尤其是在S1基因（编码σC蛋白）上存在显著遗传分化。研究还通过系统发育和重组分析，探究了SD416与禽呼肠孤病毒（Avian Reovirus, ARV）等其他毒株间的潜在进化关联，强调了加强监测以应对病毒在全球化水禽养殖系统中传播的重要性。
摘要
全球养鸭业因新型鸭呼肠孤病毒（NDRV）的出现而面临重大挑战，其病理特征包括脾脏肿大、出血性表现和受感染鸭的坏死性病变。幸存雏鸭常遭受严重的生长迟缓。本研究调查了中国山东省商品雏鸭爆发的一次肝脏坏死疫情。在排除其他潜在病原后，分离得到一株NDRV毒株，命名为SD416。该毒株在鸡胚和鸭胚中均表现出感染性，并在Vero细胞中诱导合胞体形成。全基因组测序显示其基因组为23,420 bp的双链RNA，包含10个节段，与中国的其他鸭呼肠孤病毒分离株存在显著的遗传差异。系统发育分析表明，SD416在遗传上不同于已知的鸭呼肠孤病毒毒株，尤其是在M2和S3基因内部。此外，与其他基因分型簇的毒株相比，其σC蛋白编码序列表现出极高的遗传变异性。为评估SD416的年龄依赖性致病力，用滴度为1×106TCID50/0.1 mL、含病毒量为0.1 mL的尿囊液对1、7和14日龄的雏鸭进行肌肉接种。该毒株表现出显著的年龄相关毒力：1日龄雏鸭发生严重的肝脏和脾脏病变导致死亡，而7日和14日龄接种的雏鸭仅表现出脾脏病理变化并在整个研究期间存活。本研究从组织嗜性、发病机制、基因组结构和进化关系等方面对SD416毒株进行了全面表征。我们的研究结果揭示了与该新型分离株相关的独特基因组和毒力模式，为理解NDRV的生物学特性提供了重要见解。这些结果强调，需要加强监测并制定有针对性的干预策略，以限制该病毒在全球水禽生产系统中的传播。
引言
新型鸭呼肠孤病毒是呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属的成员，可导致多种鸭类的肝脏和脾脏发生严重的出血性坏死病变，从而对全球水禽产业构成重大威胁。该病最初于1950年在番鸭中描述。自2005年起，在死亡的北京鸭雏鸭中发现了一种与高死亡率和显著脾脏坏死相关的独特呼肠孤病毒。这种病原体表现出与经典番鸭呼肠孤病毒不同的致病特性，被命名为新型鸭呼肠孤病毒。NDRV具有更广泛的宿主范围，能够感染多种鸭和鹅。其发病率和死亡率与宿主年龄呈负相关，幼龄禽类死亡率显著更高。NDRV是一种无包膜病毒，具有二十面体衣壳和双链RNA基因组。基因组RNA由10个节段组成，可根据电泳迁移率按大小分为三类：大、中、小。这些节段共同编码至少12种病毒蛋白，包括σC、σB、σA和σNS等结构成分，它们在病毒附着、细胞进入和免疫逃避中起关键作用。基因组可塑性，特别是编码外衣壳蛋白的基因的可塑性，导致了NDRV显著的遗传多样性和不断演变的抗原特性。σC蛋白是病毒中和和细胞嗜性的主要决定因素，在不同毒株间显示出相当大的序列变异。当前的监测数据表明，NDRV的全球分布正在扩大，在东亚和东南亚（特别是中国的山东、河北和河南等省份）流行率最高。由于其高发病率、高死亡率及广泛的宿主特异性，NDRV已成为影响中国鸭生产的最重要的传染病之一。因此，持续监测水禽种群中流行和新兴的NDRV毒株至关重要，这是制定有针对性的预防和控制策略的关键步骤。本研究从中国山东省一家商品鸭场的患病雏鸭肝脏中分离到一株新型鸭正呼肠孤病毒毒株，命名为SD416。我们进行了流行病学追踪、病原分离鉴定和全基因组测序。此外，还进行了体外和体内实验，以评估该分离株在幼鸭中的致病性及其潜在机制。本研究旨在增进对SD416毒株致病机制的理解，并为了解跨宿主物种的潜在重组病毒的进化关系提供新见解。
材料与方法
动物与伦理声明
实验用无特定病原体鸭由山东浩泰实验动物育种有限公司提供，饲养在配备高效颗粒空气过滤器的负压隔离器中。所有动物实验均获得扬州大学动物福利与伦理审查委员会的批准，并依据《农业动物研究与教学中护理和使用指南》的指导方针进行。
病毒分离与鉴定
2023年4月，从山东省一家樱桃谷鸭商品鸭场采集了5份表现出特征性病理病变的肝脏组织样本。将采集的肝脏样本单独匀浆后进行后续分析。经三轮冻融后，匀浆液离心取上清用于病毒分离和RNA提取。用试剂盒提取总RNA并合成cDNA。通过使用特异性引物的PCR扩增cDNA，靶向检测包括NDRV在内的主要水禽病原体。NDRV阳性的样本通过绒毛尿囊膜途径接种9日龄无特定病原体鸭胚和鸡胚。接种的胚胎在37°C孵育5天，每日监测两次存活情况。从接种后24小时内死亡的胚胎中无菌收获绒毛尿囊膜和液体，随后在鸭胚中传代。所有样本的一致性阳性结果证实了NDRV的成功分离，随后的测序分析表明，所有五个分离株代表了相同的病毒毒株，命名为SD416。
病毒纯化与透射电子显微镜观察
细胞裂解液通过超速离心纯化。将所得沉淀重悬于磷酸盐缓冲盐水中。用2%磷钨酸负染后，使用透射电子显微镜观察病毒粒子。
生长特性与病毒滴度测定
鸭胚尿囊液的第三代稀释后接种Vero和DF-1细胞单层。感染细胞在37°C、5% CO2条件下培养，每日监测细胞形态变化和细胞病变效应的发展。当Vero细胞中细胞病变效应进展超过80%时，培养物经三次冻融循环处理。离心收集上清，制备病毒悬液的系列稀释液用于感染96孔板中的Vero细胞。采用Reed-Muench法测定50%组织培养感染剂量。
动物攻毒实验
在不同日龄的雏鸭中评估SD416的致病力。总共31只1日龄无特定病原体鸭随机分为四组。第I组在1日龄时肌肉接种0.1 mL SD416病毒悬液，第II组和第III组分别在7和14日龄时接种相同剂量。第IV组作为年龄匹配的阴性对照，通过相同途径给予0.1 mL磷酸盐缓冲盐水。每日观察雏鸭的临床症状直至感染后7天。记录体重，并在感染后1、3、5和7天采集喉头和泄殖腔拭子。试验期间死亡的雏鸭立即进行尸检，并采集脾脏和肝脏样本用于实时定量PCR检测病毒RNA。感染后7天，所有存活的雏鸭在深度麻醉下通过颈椎脱臼法安乐死。然后对所有受试动物进行尸检。收集包括心脏、脾脏、肝脏、肺、肾脏、胸腺、胰腺和法氏囊在内的组织样本，用于通过实时定量PCR检测病毒载量。同时，将肝脏和脾脏样本浸入10%中性缓冲福尔马林中固定，用于组织病理学处理。
完整基因组节段扩增与测序
使用基于GenBank中鸭呼肠孤病毒序列保守区域设计的引物，通过PCR扩增SD416毒株节段1-10的完整基因组序列。将扩增产物纯化，随后克隆到平末端载体中。对每个基因组节段，选择三个独立的阳性克隆进行Sanger测序。
分析与讨论
病毒分离与鉴定
所有五份肝脏组织样本通过RT-PCR检测均为新型鸭呼肠孤病毒阳性。对扩增产物的测序证实，所有样本含有相同的病毒毒株，命名为SD416。PCR筛查证实不存在其他常见鸭病原体。所有接种的无特定病原体鸭胚和鸡胚在第二次传代期间于72-96小时内死亡，表现出严重的皮下出血。病毒粒子经纯化和负染后进行透射电子显微镜观察。病毒粒子呈球形，无包膜，具有二十面体对称性，直径约70 nm。为评估细胞嗜性和合胞体形成，用SD416感染Vero和DF-1细胞系。在Vero细胞中，接种后24-48小时内观察到以细胞变圆、折光性增强和脱落为特征的细胞病变效应。相比之下，DF-1细胞中的细胞病变效应直到接种后120小时才显现。病毒复制动力学分析显示，SD416在Vero和DF-1细胞中均在接种后36小时达到峰值滴度。这些形态学和细胞病变特征与呼肠孤病毒的特征一致。
NDRV感染鸭的临床症状与尸检变化
为评估SD416的年龄依赖性致病力，对不同日龄的雏鸭进行肌肉接种，并监测临床症状和大体病变。所有攻毒的雏鸭均表现出嗜睡、厌食和沉郁等临床症状。死亡率仅见于第I组（1日龄），该组发生两例死亡，并伴有更严重的临床表现。对照组未检测到异常。大体检查显示，1日龄感染鸭的肝脏表面有出血点，但在日龄较大的组中未见。所有1日龄感染鸭均表现出脾脏病变，包括肿胀、出血、黄白色坏死灶，严重时完全坏死，病变发生率为100%。尽管7日和14日龄感染鸭也表现出脾脏肿胀和坏死，但病变的发生率和严重程度降低。对照组鸭未见病变。组织病理学分析证实了肝脏和脾脏的显著病变。1日龄鸭的肝细胞充血和肿胀明显，但在日龄较大的组中缺失。脾脏结构显示部分破坏和淋巴细胞耗竭，病变严重程度随年龄增长而降低。这些结果表明，SD416诱导的肝脏和脾脏病变的严重程度与宿主年龄呈负相关。1日龄和7日龄雏鸭表现出更高的易感性，表现为与14日龄鸭相比更频繁和更严重的脾脏病理变化。
体重增加在感染后5、7天时，1日龄和7日龄感染鸭与对照组相比显著降低，而14日龄鸭仅显示轻度降低。通过实时定量PCR定量泄殖腔和喉头拭子中的病毒载量。所有感染组的病毒排出量均在感染后3天达到峰值，且泄殖腔拭子中的病毒排出量显著高于喉头拭子，这表明粪-口传播是主要途径。组织嗜性也具有年龄依赖性。在1日龄鸭中，在心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、胸腺、胰腺和法氏囊中检测到病毒，脾脏中的病毒载量最高。7日和14日龄鸭的病毒载量显著降低，且主要局限于脾脏，这表明SD416在脾脏组织中复制效率最高，并且病毒复制能力随宿主年龄增长而下降。总之，这些发现表明，对SD416的年龄相关抵抗力与病毒复制减少和组织播散有限有关，突显了宿主年龄在NDRV感染易感性中的关键作用。
呼肠孤病毒的全球分布
σC基因被广泛认为是区分和分类正呼肠孤病毒分离株的遗传标记。为阐明基于σC基因的进化关系，我们获取并分析了160条水禽呼肠孤病毒序列。系统发育分析显示，这些序列形成了四个不同的簇：103个分离株位于禽呼肠孤病毒分支内，47个位于新型鸭呼肠孤病毒分支内，8个位于番鸭呼肠孤病毒分支内，2个位于鹅呼肠孤病毒分支内。此外，103条禽呼肠孤病毒σC序列被细分为六个亚支。毒株SD416与大多数中国分离株一起聚集在新型鸭呼肠孤病毒分支内，并与毒株N-DRV/LY20显示出密切的系统发育关系。
水禽呼肠孤病毒在全球分布。禽呼肠孤病毒于1954年在加拿大多伦多大学康诺特医学研究实验室首次鉴定。此后，美洲、欧洲、亚洲、大洋洲和非洲均有禽呼肠孤病毒的报告。在中国，王锡堃于1985年首次描述了该病。番鸭呼肠孤病毒最初在非洲报道，此后在欧洲和亚洲被鉴定。在中国，该病自1997年起在浙江和福建的番鸭雏鸭中观察到，并于2001年由吴宝成等确认为番鸭呼肠孤病毒。新型鸭呼肠孤病毒于2005年首次在福建省检测到，随后在广东和浙江等主要水禽产区成为地方性流行。
SD416的完整基因组
通过RT-PCR扩增了毒株SD416节段1-10的完整基因组序列，并使用cDNA末端快速扩增技术确定了每个节段的末端序列。SD416的完整基因组总长度为23,420 bp。10个节段的大小如下：L1、L2、L3、M1、M2、M3、S1、S2、S3和S4。开放阅读框预测显示，除S1外，所有节段均为单顺反子，分别编码蛋白λA、λB、λC、μA、μB、μNS、σA、σB和σNS。S1节段包含三个部分重叠的开放阅读框，编码P10、P18和σC。
将SD416的每个蛋白序列用作BLASTp同源性搜索的查询。毒株N-DRV/LY20与SD416的相应蛋白显示出最高的氨基酸同一性。
系统发育分析与序列比较
为阐明本研究中鉴定的新型鸭病毒与其他正呼肠孤病毒之间的进化关系，基于所有10个基因组节段的开放阅读框，使用最大似然法构建了系统发育树。每个节段显示出不同的聚类模式，形成了对应于不同基因组群的两个主要进化支：鸡相关和水禽相关。根据已建立的禽呼肠孤病毒基因分型标准，水禽基因组群可进一步细分为两种基因型：水禽基因型I和水禽基因型II。系统发育分析始终将SD416分离株置于新型鸭呼肠孤病毒谱系内，表明它代表了一种不同于先前表征的禽呼肠孤病毒的新出现的中国正呼肠孤病毒毒株。
病毒节段间的基因重组促进了基因组多样性，病毒分类通常依赖于高变基因区域。在水禽呼肠孤病毒中，较长的基因组节段通常表现出比中小节段更低的遗传变异性。基于λ类基因的系统发育，SD416毒株在λA和λC基因中与LY20、YL和CD200801毒株显示出密切的进化关系。相比之下，尽管这些毒株总体上聚集在同一主要分支内，但它们的λB基因中观察到显著的分化，表明病毒分化仍在进行中。M类节段的分析表明，SD416在μB和μNS基因中与LY20、XT18和SDYC毒株聚在一起。然而，μA基因显示出独特的系统发育模式。在σ类基因中，观察到最大的系统发育分化。σC基因编码水禽呼肠孤病毒的主要中和抗原和细胞附着蛋白，在所有10个基因组节段中表现出最显著的进化分离，表明SD416经历了独特的进化轨迹。相比之下，σA和σNS基因的系统发育显示SD416与LY20形成一个进化支，与在λA、μA和μB节段中观察到的拓扑结构一致。这种跨多个基因组区域的共线性表明这些毒株之间具有共享的进化起源和功能保守性。
总之，在10个基因组节段中观察到的系统发育不一致表明，毒株SD416可能经历了复杂的进化事件。不同的聚类模式，特别是λB、μA和σC节段的独立进化轨迹，提供了强有力的基因组证据，暗示可能与其它流行的禽正呼肠孤病毒发生潜在重配或节段特异性重组，而不是简单地从单一前体线性传代。
全基因组比对的可视化与氨基酸序列分析
基因组的可视化揭示了SD416毒株与其他11株正呼肠孤病毒毒株基因组之间的一系列差异区域。SD416毒株与GX-2010-1、138、1733和S1133毒株的序列相似性较低，表明与这些禽正呼肠孤病毒存在相当大的遗传距离。SD416毒株与鸭源毒株FJ19、091、TH11和03G具有高度的遗传相关性，但与番鸭毒株相比，在L3、M2和S3节段中序列相似性较低。这种显著的分化在S1基因中尤为关键，该基因与经典番鸭呼肠孤病毒和禽正呼肠孤病毒的序列同一性低于50%，从而排除了它们参与导致SD416出现的重组事件的可能性。
可视化清楚地划分了SD416与经典禽和番鸭呼肠孤病毒。最关键的是，跨越S1节段的广泛分化，该节段编码主要的抗原和细胞附着蛋白σC，为SD416所代表的显著遗传转变提供了视觉和定量确认。这种大规模的分化很可能构成了观察到的独特表型特征的基础，并暗示了实质性的抗原漂移，这对交叉保护和诊断分析设计具有直接影响。
对λB、λC、μA、σB、σC、P10和P18蛋白的比较比对显示，SD416毒株在特定残基上与其它17株中国新型鸭呼肠孤病毒毒株存在差异。关键差异包括λB中的三个替换，λC中的五个替换，μA和σB中各两个替换，σC中的四个替换，以及P10和P18中各一个替换。此外，2018年及之后收集的分离株具有一组独特的突变。总之，这些发现共同表明，点突变的积累很可能构成了SD416毒株与其他新型鸭呼肠孤病毒毒株在σC、P10和P18蛋白中观察到的序列分化的基础，可能导致它们独特的表型特征。
呼肠孤病毒的基因重组
基因重组是驱动病毒进化和遗传多样化的关键机制。为检测64株水禽呼肠孤病毒分离株中潜在的基因内重组事件，我们使用软件筛选了新型鸭呼肠孤病毒SD416毒株的10个基因组节段以及参考序列。这种多方法分析为λB、μA、σA和σNS四个节段中可能的重组提供了证据。
对于这些节段中的每一个，分析都确定了特定的断点坐标。观察到的λB基因模式与涉及新型鸭呼肠孤病毒/禽呼肠孤病毒作为主要和次要亲本的重组事件一致。同样，μA、σA和σNS基因显示出与各种流行的新型鸭呼肠孤病毒/禽呼肠孤病毒毒株间潜在重组的系统发育和相似性图信号。
这些分析共同表明，SD416的基因组可能受到新型鸭呼肠孤病毒和禽呼肠孤病毒谱系之间重组的影响。
讨论
新型鸭呼肠孤病毒变体的不断出现突显了禽正呼肠孤病毒的动态进化，并对全球水禽健康构成重大挑战。本研究表征了一株新鉴定出的新型鸭呼肠孤病毒毒株SD416，该毒株与先前报告的分离株存在显著的遗传差异。
在这项研究中，从患病樱桃谷鸭的肝脏组织中分离到一株呼肠孤病毒毒株，命名为SD416。该分离株在鸭胚和鸡胚中均诱导死亡，并在Vero和DF-1细胞系中高效复制。透射电子显微镜显示无包膜病毒粒子具有二十面体对称性和双层衣壳结构，与典型的禽正呼肠孤病毒形态一致。全基因组测序表明，SD416基因组包含23,420 bp，其节段长度相对于其他已知的新型鸭呼肠孤病毒参考毒株高度保守。
我们逐节段的系统发育分析揭示了显著的系统发育不一致，除了确认新型鸭呼肠孤病毒基因型外，还强调了这些病毒的基因组可塑性。编码核心聚合酶成分、外衣壳蛋白和非结构蛋白的基因各自讲述略有不同的进化故事，这一事实突显了水禽呼肠孤病毒的进化并非单一的。这种马赛克基因组结构与以下假设一致：像SD416这样的新型变体可以通过对水禽种群中共同流行的不同亲本毒株的基因组节段进行重配而出现，从而快速产生遗传和潜在的表型多样性。
σC蛋白是细胞受体结合的主要病毒附着蛋白，在病毒吸附和合胞体形成中起关键作用。值得注意的是，在SD416的σC蛋白中鉴定出的氨基酸替换中，S100N和M151T尤其令人关注。与已知禽正呼肠孤病毒σC蛋白的结构比对表明，这些残基位于或邻近预测的受体结合域和主要抗原表位内。具体来说，这些位点映射到负责受体附着的C末端β-桶头结构域，并与被识别为变异特异性免疫显性表位的区域重叠。这一位置信息为这些突变的潜在功能影响提供了基于序列的支持。基于此分析，我们假设S100N和M151T替换可能改变宿主细胞嗜性，并促进逃避现有疫苗株引发的中和抗体，这可能对疫苗交叉保护产生影响。为直接验证这一假设，未来需要进行中和试验、受体结合试验以及变异σC蛋白的结构建模/比较分析。
全基因组比对可视化进一步补充了系统发育和重组分析。它不仅证实了SD416的整体遗传独特性，还空间映射了变异最高的区域。S1节段中显著的分化直接与我们鉴定出的σC、P10和P18蛋白中的独特突变集相关。这种整合观点与以下观点一致：选择压力（可能来自宿主免疫）可能正在驱动该关键病毒-宿主相互作用区域的集中进化。因此，该图不仅仅是距离的表示，更是突出可能控制像SD416这样的新兴新型鸭呼肠孤病毒毒株改变的嗜性和致病性的基因组“热点”的图谱。
同样值得注意的是，在SD416和参考毒株之间的M2节段中观察到了显著的遗传差异，这表明对鸭呼肠孤病毒的基因组研究应扩展到S类基因之外。有趣的是，尽管μB编码基因存在相当大的核苷酸序列差异，但该分离株与参考毒株之间产生的氨基酸变化相对保守。除了点突变，基因重组是分段双链RNA病毒进化的主要驱动力，促进具有改变毒力的新型变体的出现和传播。
值得注意的是，我们的分析为SD416的λB、μA、σA和σNS基因中可能的重组提供了证据。SD416的马赛克
