《Frontiers in Animal Science》：Innovative reproductive management in rabbits: GnRH-free insemination with specifically designed cannulas for nulliparous and multiparous does
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本综述介绍了一种针对兔人工授精（AI）的无激素（GnRH）替代方案。研究结合了新西兰白兔经产与未产母兔阴道远端6厘米的组织学分析，发现其内机械感受器分布存在差异，并据此设计了两款针对不同生殖状态的定制化3D打印授精导管。农场试验表明，通过“双次物理刺激”操作流程，使用适配的导管可获得与肌肉注射促性腺激素释放激素（GnRH）类似物相媲美的受孕率，且不损害产仔数。这为开发一种维持繁殖效率、同时提升动物福利的可持续AI系统提供了有力证据。
引言
人工授精（AI）是现代商业化兔生产中的关键技术，但其成功目前仍高度依赖外源性促性腺激素释放激素（GnRH）类似物来诱导排卵，这引发了关于动物福利和长期可持续性的担忧。兔是诱导排卵动物，其排卵需要交配相关的体感刺激触发神经内分泌反射。虽然将GnRH类似物加入授精剂量可改善动物福利，但其生物利用度低，通常需要比肌肉注射高25-30倍的剂量才能达到相当的促排卵效果，且长期反复使用可能对母体内分泌平衡产生负面影响。研究指出，兔的排卵依赖于两条平行通路：阴道和宫颈通路的机械刺激，以及精浆内分泌成分的旁分泌信号。物理刺激对于触发兔排卵至关重要。近期证据表明，仅插入合适的导管即可诱导排卵，但结果因设备设计和母兔生殖状态（未产 vs. 经产）而有显著差异。为探究这些差异的潜在组织学基础，本研究检查了未产和经产兔阴道初始6厘米（被认为是交配刺激最主要涉及的区域）的组织学特征，旨在识别可解释生育力差异的机械感受器变化。同时，本研究评估了一款专为未产母兔设计的新型更薄的3D打印授精导管，并验证了另一款较厚导管在经产母兔中的效果。
材料与方法
研究在瓦伦西亚农业研究所（IVIA）动物研究与技术中心（CITA）的实验农场进行。使用性成熟的新西兰白兔。组织学部分，收集了6只发情母兔（3未产，3经产非哺乳）的阴道组织，对其前6厘米进行分段处理，制作石蜡切片，进行苏木精-伊红、甲苯胺蓝染色及细胞角蛋白20（CK20）免疫组化分析，以识别上皮下机械感受器（帕西尼小体、鲁菲尼小体和梅斯纳小体）、上皮受体（梅克尔细胞）和阴道旁神经节。授精实验部分，使用12只公兔采集精液，评估后制备授精剂量。研究设计并3D打印了两款导管：用于经产母兔的较厚导管（最小直径8毫米，最大直径10毫米）和用于未产母兔的较薄导管（最小直径6毫米，最大直径8毫米）。总共进行了289次授精，母兔按生殖状态分组。在授精时，应用了三种操作流程：导管单次插入（单次刺激）、导管插入两次（间隔5分钟，双次刺激，第二次插入时注入精液），以及对照组（单次插入导管并肌肉注射1微克布舍瑞林）。操作由两名操作员独立完成。记录分娩率和产仔数。使用广义线性模型（GLM）进行统计分析。
结果
组织学结果
上皮下机械感受器在阴道近端（前2厘米）浓度最高，向远端区域密度逐渐降低。在分析的机械感受器中，仅帕西尼小体的浓度在未产母兔中显著高于经产母兔。梅克尔细胞的密度在两组间无显著差异，但沿阴道深度有显著的空间变异，其密度从第三厘米开始逐渐增加，在研究管道的最远端段达到峰值。神经节主要分布在距阴道口4至6厘米深度的疏松结缔组织中。经产母兔的神经节面积显著大于未产母兔，但未产母兔的神经元密度（每平方毫米神经节内的神经元数量）显著更高。
授精结果
在所有分析的因子中，授精技术和母兔生殖状态对生育力结果有显著影响，而操作员之间未发现显著差异，表明操作的可重复性。在未产母兔组中，当使用较薄导管进行双次刺激时，分娩率达到93%，与肌肉注射GnRH类似物的对照组（79%）相当。在经产母兔组中，使用较厚导管的双次刺激也将分娩率提高至76%，与激素对照组（85%）水平相当。总体而言，重复物理刺激提高了未产和经产母兔的分娩率。在总产仔数和活产仔数方面，各实验组间未观察到显著差异。
讨论
本研究为兔传统人工授精方法提供了一种高效的无激素替代方案，推动了激素使用的减少，并在改善动物福利方面迈进了一步。兔生殖道具有密集的肾上腺素能神经支配。阴道上皮中的梅克尔细胞通过SNARE依赖性化学突触释放去甲肾上腺素，与表达β2肾上腺素能受体的纤维形成突触。激活β2-肾上腺素能受体可引发持续反应。在此背景下，交配刺激已被证明能激活去甲肾上腺素能下丘脑区域，导致去甲肾上腺素释放，随后诱导排卵。机械感受器进一步增加了兔阴道感觉的复杂性。梅斯纳样小体可能介导阴道下部和阴蒂区域的精细触觉感知。鲁菲尼终末感受拉伸和组织变形。帕西尼小体则对高频振动和瞬变压力的检测起关键作用，其在未产母兔中观察到的更高密度可能解释了它们在导管机械刺激下更高的排卵率。在经产母兔中，反复分娩会诱导组织重塑，可能降低帕西尼小体的普遍性和敏感性，这在一定程度上解释了它们对导管诱导刺激的反应性降低。我们的研究结果表明，生殖状态直接决定了排卵的机械阈值。在未产母兔中，完整的阴道组织学和高受体密度允许使用更薄的导管成功诱导。相比之下，经产母兔的组织重塑似乎使阴道管脱敏，需要更强烈的刺激。因此，调整导管直径不仅是一个技术选择，更是对这些组织学变化的必要补偿，以确保足够的机械张力来触发不同生殖阶段的神经内分泌级联反应。神经节主要表现出副交感神经特征。未产母兔拥有更高密度的完整神经回路和感觉神经支配，提供了比经产母兔重塑组织更具反应性的神经内分泌框架。这些生理适应有助于解释先前授精研究中观察到的未产和经产母兔之间的生育力差异，凸显了使导管设计适应特定生殖状态的重要性。双刺激技术的有效性在于其能够有效激活排卵所需的神经内分泌反射。该序贯方案提供了累积的感觉输入，模拟了兔自然交配特有的重复体感刺激。我们的结果表明，使用本研究开发的导管进行双刺激技术，在经产和未产母兔中诱导的排卵率与通过肌肉注射GnRH类似物达到的排卵率相当。操作员之间无显著差异支持了该技术的稳健性，并强调了其在商业农场条件下实际应用的适用性。通过根据生殖状态优化导管设计和刺激方案，可以实现与当前激素标准相媲美的生育结果。向无激素、注重动物福利的方法转变，不仅满足了不断变化的消费者期望和伦理标准，也为提高兔生产系统的长期韧性和可持续性提供了可扩展的战略。
