《Frontiers in Immunology》：IFNγ-induced antigen loss in chimeric antigen receptor-T cell therapy
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本文揭示了干扰素γ（IFNγ）在CAR-T细胞治疗中一个未被认识的作用：它通过激活IFNγR/JAK/STAT1通路及后续的内质网应激反应，诱导旁观者结直肠癌细胞丢失靶抗原（GUCY2C、CDH17、HER2），从而削弱CAR-T疗效。研究发现，使用抗IFNγ中和抗体、JAK抑制剂（ruxolitinib）或内质网应激缓解剂（4-phenylbutyrate）可逆转此抗原丢失现象。这一新机制为改进针对实体瘤的CAR-T及双特异性T细胞衔接器（BiTE）疗法提供了潜在的联合治疗策略。
引言
免疫疗法已成为继手术、化疗、放疗之后的癌症治疗第四大支柱。嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法在血液肿瘤治疗中取得了革命性成功，但在结直肠癌等实体瘤中尚未获得突破。鸟苷酸环化酶C（GUCY2C）已成为结直肠癌CAR-T和双特异性T细胞衔接器（BiTE）疗法的一个临床阶段靶点。干扰素γ（IFNγ）传统上被认为通过增强抗原处理和HLA呈递、诱导粘附分子表达以稳定免疫突触等方式，有益于T细胞的效应功能，对CAR-T靶向实体瘤至关重要。然而，本研究揭示了一种由IFNγ介导的、前所未有的抗原丢失机制，限制了CAR-T在结直肠癌中的疗效。
结果
GucyCART在低抗原模型中疗效有限并诱导GUCY2C丢失
在临床前模型中，靶向GUCY2C的CAR-T细胞（GucyCART）能有效治疗高表达GUCY2C的T84细胞建立的肿瘤。然而，在表达较低水平GUCY2C mRNA和蛋白的LS174T和LoVo细胞模型中，GucyCART的体内疗效有限。体外共培养实验显示，GucyCART能以剂量依赖方式裂解这些低抗原细胞，但裂解速度较慢且不完全。重要的是，在裂解后存活的癌细胞中，GUCY2C的mRNA和蛋白水平显著降低，提示可能存在抗原丢失变异的选择。
GUCY2C丢失发生在未与CAR-T直接接触的旁立者癌细胞中
既往研究表明，CAR-T诱导的抗原丢失机制依赖于CAR-T细胞与肿瘤细胞的直接接触以施加选择压力。出乎意料的是，本研究发现，仅用活化的GucyCART细胞或无CAR的活化T细胞的条件培养基处理新鲜的结直肠癌细胞，同样能导致GUCY2C蛋白和mRNA水平的显著下降。这表明，GUCY2C的丢失可由T细胞分泌的可溶性因子介导，且无需癌细胞与CAR-T细胞直接接触，这是一种“旁立者”效应。
GUCY2C丢失由IFNγR-JAK-STAT1信号轴介导
通过细胞因子筛选，研究人员发现，在多种由活化T细胞分泌、且其受体在结直肠癌细胞上表达的细胞因子中，仅IFNγ能够复刻GucyCART或T细胞条件培养基诱导的GUCY2C蛋白和表面表达下降。机制研究表明，IFNγ与其受体（IFNγR）结合后，激活了与之相关的Janus激酶JAK1和JAK2，进而磷酸化信号转导和转录激活因子1（STAT1）。使用IFNγ中和抗体、JAK1/2抑制剂ruxolitinib，或利用CRISPR-Cas9技术敲除JAK1/2，均能有效阻断条件培养基诱导的STAT1磷酸化，并阻止GUCY2C的丢失。这证明IFNγ通过经典的IFNγR-JAK1/2-STAT1信号通路导致抗原丢失。
IFNγ诱导的GUCY2C丢失由细胞应激信号介导
转录组学分析显示，用CAR-T条件培养基处理的LS174T细胞中，除了IFNγ反应等通路被上调外，内质网未折叠蛋白反应（UPR）通路也显著上调。UPR是细胞在炎症应激下调节蛋白质生产的关键信号机制。蛋白水平验证表明，T细胞条件培养基可诱导UPR关键蛋白CHOP的表达上调，而此效应可被IFNγ中和抗体或ruxolitinib所阻断。此外，用已知的UPR化学诱导剂衣霉素处理细胞，也能增加CHOP并降低GUCY2C蛋白水平。这些结果表明，IFNγ通过激活JAK/STAT1下游的应激信号通路（特别是UPR）来诱导GUCY2C丢失。
4-苯基丁酸可逆转IFNγ诱导的GUCY2C丢失并实现更完全的癌细胞清除
基于上述发现，研究人员探讨了逆转应激信号能否恢复抗原并改善CAR-T功能。4-苯基丁酸（4PBA）是一种小分子化学伴侣，可减轻内质网中的蛋白质错误折叠应激。实验发现，4PBA能在不影响IFNγR/JAK/STAT1经典信号通路（STAT1磷酸化得以保留）的情况下，降低CHOP蛋白水平，并恢复GUCY2C蛋白表达。更重要的是，在体外杀伤实验中，与GucyCART单药相比，联合使用4PBA能提高对LS174T和LoVo细胞的裂解速度和彻底性。
讨论
本研究在结直肠癌模型中揭示了一种新型的、由IFNγ介导的CAR-T抗原丢失机制。与传统认知的、依赖于CAR-T直接选择压力（如基因突变、等位基因丢失、选择性剪接）的抗原逃逸机制不同，此机制通过可溶性IFNγ作用于“旁立者”癌细胞，无需直接细胞接触。其核心路径是：活化CAR-T分泌IFNγ → 与癌细胞IFNγR结合 → 激活JAK1/2 → 磷酸化STAT1 → 诱导内质网应激（UPR） → 导致靶抗原（GUCY2C）丢失。
这一发现揭示了IFNγ在CAR-T治疗中的双重作用：一方面，它对T细胞效应功能和免疫突触形成至关重要；另一方面，它却意外地通过诱导应激信号导致靶抗原下调，可能削弱CAR-T和同样依赖表面抗原的BiTE等免疫疗法的疗效。针对JAK通路的抑制剂（如ruxolitinib）虽可阻断抗原丢失，但也会损害IFNγ的有益作用，从而整体上不利于CAR-T疗效。因此，特异性靶向应激信号通路（如使用4PBA），而不干扰上游的IFNγ/JAK/STAT1信号，成为了更具潜力的策略。
该现象可能具有普遍性。研究发现，除GUCY2C外，结直肠癌的其他CAR-T靶点如钙粘蛋白-17（CDH17）和人表皮生长因子受体-2（HER2）的表面和总蛋白水平也会在IFNγ暴露下降低。这表明，针对天然表面抗原的免疫疗法（如CAR-T、BiTE）可能普遍受此机制影响，而针对肽-HLA复合物的疗法（如TCR-T细胞、疫苗）可能不受影响。
总之，本研究首次阐明了IFNγ通过诱导细胞应激导致CAR-T抗原丢失的新机制，为理解实体瘤CAR-T疗效受限提供了新视角。通过药理学手段（如4PBA）解除这种应激，有望在保留IFNγ有益功能的同时，防止抗原丢失，从而增强CAR-T对实体瘤的清除能力，为改善相关免疫疗法提供了新的联合治疗思路。
