《Frontiers in Immunology》：Attenuated crosstalk between urothelium and fibroblasts promotes ureteral stricture development
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本文聚焦于输尿管狭窄（US）的纤维化重塑机制，通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）与组织学验证，系统揭示了其细胞与分子层面的病理特征。研究发现，在US组织中，上皮细胞功能受损，其与成纤维细胞间的细胞间通讯显著减弱。具体而言，控制组的上皮细胞通过分泌膜联蛋白A1（ANXA1），与成纤维细胞表达的甲酰肽受体2（FPR2）相互作用，维持稳态。而该通路在US中下调，破坏了成纤维细胞的稳态，促进了纤维化。此项研究为理解US病理机制提供了新的理论框架，并提示了抗纤维化的潜在治疗靶点。
引言
输尿管狭窄（Ureteral stricture, US）是泌尿外科中一种常见且复杂的临床病症，其特征在于输尿管管腔异常狭窄，阻碍尿液从肾脏到膀胱的引流，导致上尿路梗阻性病变。若不及时诊治，US可能进展为慢性肾功能障碍，严重影响患者健康与生活质量。近年来，内镜泌尿外科技术的广泛应用使得医源性US的发生率呈上升趋势。目前US的主要治疗手段包括内镜治疗和外科手术干预，但两者均存在局限性和并发症。组织工程的进展为US治疗提供了新视角，然而，对其分子机制的有限认知制约了组织工程策略的临床转化。本研究旨在利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，系统性解析US的细胞异质性和分子机制，重点关注成纤维细胞与上皮细胞间的交互对话，从而建立理解US发病机制的理论框架并识别治疗靶点。
结果
1. 人输尿管狭窄组织的组织学特征及scRNA-seq鉴定的主要细胞类型
为阐明US组织与正常输尿管组织的差异，研究收集了狭窄组（USG）和对照组（CG）的手术样本。苏木精-伊红（HE）和马松三色（Masson’s trichrome）染色显示，与CG组织相比，USG上皮层内的上皮细胞密度显著降低，且狭窄区域的胶原纤维沉积显著增加。通过scRNA-seq，研究对总计66,031个细胞进行了分析，并识别出11种主要细胞类型，包括肥大细胞、中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、B细胞、自然杀伤T（NKT）细胞、T细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞和上皮细胞。统一流形逼近与投影（UMAP）降维显示了两组间明显的细胞分布模式差异。值得注意的是，上皮细胞和肥大细胞在对照组组织中占比较高，而成纤维细胞、自然杀伤T细胞和B细胞则在US组组织中显著增加。
2. 成纤维细胞与受损上皮细胞间的交互对话显著减少
环形图（Circos plot）可视化显示，平滑肌细胞（SMCs）和成纤维细胞（Fibs）拥有数量最多的上调差异表达基因（DEGs），而上皮细胞（Uro）则占所有下调DEGs的近半数，突出了这三类细胞在US发病机制中的关键作用。基因本体（GO）富集分析表明，US组织中上调的DEGs显著富集在四个主要功能类别中，包括蛋白质生物合成、细胞骨架重组、细胞-基质/细胞-细胞粘附以及免疫活化。而下调的DEGs则主要富集在能量代谢、蛋白质生物合成、肌肉结构与功能以及细胞粘附等通路中。
从细胞间通讯网络图分析可见，在对照组组织中，上皮细胞与成纤维细胞间存在明显的交互对话，而在US组组织中，这种相互作用显著减弱。Augur分析显示，不同细胞类型对狭窄环境的敏感性各异，其中上皮细胞敏感性评分最高（0.91），表明其在狭窄相关的病理环境中可能扮演关键角色并经历显著改变。转录因子（TF）相互作用网络分析进一步显示，上皮细胞和成纤维细胞与转录因子存在广泛连接，TF调节活性尤为显著，表明它们是网络中的主要调控枢纽。
3. 成纤维细胞亚群图谱与分化轨迹
通过对6,803个成纤维细胞的单细胞转录组学分析，研究清晰地识别出六个主要的成纤维细胞亚群：Fib-MFAP5、Fib-CXCL14、Fib-APCDD1、Fib-S100A6、Fib-CCL19和Fib-THBS1。进一步的亚群分布分析揭示了CG和USG之间的显著差异。具体而言，Fib-CCL19、Fib-CXCL14和Fib-MFAP5在US组中显著富集，而Fib-APCDD1、Fib-S100A6、Fib-THBS1在对照组中更为丰富。细胞-细胞相互作用热图描绘了对照组中上皮细胞与多个成纤维细胞亚群之间的活跃对话，而US组中，尽管成纤维细胞亚群内部的相互作用普遍增强，但上皮细胞与多个成纤维细胞亚群间的对话却急剧下降。
随后进行的伪时间（pseudotime）分析推断了成纤维细胞亚群的分化轨迹，结果显示了一个分支轨迹结构，其中不同亚群占据伪时间轴上的特定位置。Fib-THBS1、Fib-CCL19和Fib-APCDD1位于轨迹的起点，具有较高的分化潜能，而Fib-MFAP5和Fib-CXCL14则位于终末分支，反映了更成熟或特化的功能表型。CytoTRACE2评分进一步验证了Fib-THBS1亚群在所有簇中具有最高的分化潜能。
4. 上皮细胞差异表达基因分析
针对16,115个上皮细胞的全面分析，识别出四种不同的上皮细胞亚型：迁移相关上皮细胞（MG）、活性氧应答上皮细胞（ROS）、分泌及囊泡活跃上皮细胞（SV）和代谢活跃上皮细胞（MA）。值得注意的是，ROS应答上皮细胞在对照组中比例显著较高，而在US组中几乎检测不到，这表明ROS程序是赋予上皮抗氧化防御能力的基础。
差异表达基因（DEGs）热图显示，四个上皮细胞亚群各自呈现出高度表达的离散基因簇，凸显了亚型间显著的转录异质性。GO富集分析表明，这些DEGs显著富集于与GTP酶调节活性、细胞-基质粘附、蛋白激酶复合体、线粒体功能、细胞凋亡和跨膜转运相关的通路。
考虑到上皮细胞数量的显著减少，研究推测上游转录因子可能介导了这一现象。对输尿管上皮细胞中TF活性的热图分析发现，GATA3-上皮发育和KLF5-上皮发育在对照组的输尿管上皮细胞中显著富集。通过系统的基因挖掘和文献梳理，研究确定了ANXA1基因表现出特别强的成纤维细胞相关表达模式，这为后续研究指明了方向。
5. 上皮细胞中ANXA1表达下调及相关免疫验证
通过对11个不同细胞群体中ANXA1表达的系统性评估，发现其在上皮细胞和内皮细胞区室中均显著下调。为在蛋白水平验证这些转录组学发现，研究进行了免疫组织化学（IHC）分析，结果显示，与对照组相比，US来源的上皮细胞中ANXA1表达显著耗竭。随后的双重免疫荧光染色进一步支持了这些发现，证明了转录因子KLF5与ANXA1的显著共定位，以及ANXA1与FPR2在组织内的共定位。重要的是，在US组中，KLF5、ANXA1和FPR2的整体表达水平均下调，这表明该分子轴可能在US的发展过程中失调。KLF5（一种上游调控因子）的下调可能导致ANXA1转录减少，进而通过ANXA1-FPR2通路影响细胞功能，并参与US的发病。此外，免疫荧光分析证实了成纤维细胞标志物DCN与FPR2受体在同一组织区域内的共定位。
讨论
当前US的管理策略主要涉及手术切除或腔内介入治疗。尽管短-中段US通常对常规手术反应良好，但长段US通常需要复杂的自体组织移植重建手术，这会带来显著的并发症并损害生活质量。腔内治疗（主要是输尿管支架植入）旨在维持尿路通畅。近期研究集中于用抗纤维化药物（如吡非尼酮、雷帕霉素）涂层支架，旨在局部抑制狭窄部位的成纤维细胞活化和细胞外基质（ECM）沉积。这些进展凸显了阐明US分子发病机制以识别新治疗靶点和指导精准干预开发的迫切需求。
本研究利用scRNA-seq技术全面分析了66,031个输尿管细胞，为输尿管纤维化过程中的细胞动态提供了无偏倚的单细胞分辨率图谱。分析揭示了US组织中细胞组成和功能状态的显著重塑。组织病理学评估证实了US样本中上皮层的显著结构破坏和狭窄区域的胶原过度沉积，确立了以异常ECM积聚为特征的输尿管纤维化是驱动US的核心病理生理过程。
基于这些观察，我们深入探究了上皮细胞耗竭和成纤维细胞介导的ECM过度积聚的机制。单细胞测序数据显示，与对照组相比，狭窄组织中上皮细胞比例显著降低且功能受损，同时成纤维细胞和平滑肌细胞活性显著升高。细胞间通讯分析显示，正常输尿管中存在活跃的上皮-成纤维细胞交互对话，而在狭窄组织中，这种对话被显著削弱。转录因子相互作用网络分析进一步表明，这两种细胞类型均与几个关键转录因子密切相关，显示出强大的转录活性。这些比较分析提出了一个问题：上皮细胞功能的减弱是否与成纤维细胞的活化密切相关？结合其他器官纤维化研究的结果，上皮与基质细胞的相互作用已被认为与纤维化的启动和进展相关。这些结果表明，上皮-基质细胞交互对话的破坏可能在输尿管纤维化中起到关键作用。
为了更深入了解上皮细胞和成纤维细胞在输尿管纤维化中的作用，我们进行了亚群分析。在成纤维细胞亚群中，THBS1+亚型不仅在对照输尿管组织中比例更高，而且表现出更大的分化潜能。该亚群在US组织中的特异性耗竭为纤维化进展的动态提供了关键见解。虽然THBS1经典上以其抗血管生成特性而闻名，但我们的轨迹和CytoTRACE2分析将Fib?THBS1识别为位于成纤维细胞谱系起点的高潜能祖细胞亚群。US组中该群体的减少，应理解为这些祖细胞的消耗性分化，转变为下游的效应表型，特别是分化为终末分化的促纤维化簇，如Fib?MFAP5和Fib?CXCL14。这种祖细胞库的耗竭，可能通过减弱抗血管生成活性而加剧纤维化进展，进而为成纤维细胞扩张提供血管生态位，加速ECM沉积。
上皮细胞亚群分析显示，活性氧（ROS）应答上皮细胞在对照组中更为丰富，而该亚群在狭窄组织中显著减少。这表明在生理条件下，上皮细胞通过抗氧化防御机制保护输尿管。然而，尿路结石形成及相关干预诱发的输尿管上皮损伤显著损害了这种抗氧化能力。这种特化抗氧化防御的丧失使上皮易于受到氧化损伤，这一结论得到了GO富集分析结果的支持。剩余上皮细胞中与“线粒体功能”和“细胞凋亡”相关基因的显著富集，为持续的氧化应激损伤提供了分子证据，因为线粒体功能障碍是ROS积累的主要后果，也是已知的程序性细胞死亡触发因素。最终，这种缺陷可能使输尿管易于受到尿液的强烈理化刺激，引发炎症和纤维化。
对上皮细胞的转录因子分析确定KLF5为高度富集的调节因子。作为Krüppel样因子（KLF）家族的成员，KLF5是系统发育上保守的一类转录因子，协调控制细胞增殖、分化、迁移、凋亡、炎症反应、屏障功能和代谢适应等基因的表达。这一发现促使我们探究KLF5的下游靶点。通过整合文献挖掘和转录组学分析，我们确定了ANXA1是KLF家族的关键转录靶点。在功能上，ANXA1通过其N端肽段介导抗炎和组织修复过程，该肽段经蛋白水解切割以激活下游信号。
随后的表达分析显示，ANXA1在上皮细胞和内皮细胞中均显著下调，这与观察到的上皮功能损伤一致。然而，仅ANXA1的缺失无法完全解释成纤维细胞的过度活跃。文献回顾强调了甲酰肽受体（FPR），一种经过验证的炎症调节因子，是潜在的介质。研究表明，在肠组织中，ANXA1作为内源性FPR配体，激活ROS依赖性信号以促进上皮伤口愈合——这一机制与我们的发现一致。此外，在食管癌中，通过ANXA1-FPR的上皮-成纤维细胞对话驱动疾病进展，在急性肾损伤（AKI）模型中，损伤增强了上皮与基质细胞间的配体-受体信号传导。这些研究共同强调了上皮-基质通讯在组织稳态中的关键作用，考虑到上皮和肾脏具有共同的中胚层起源，这种进化保守性可以解释输尿管和肾组织在基质细胞调控方面的分子相似性。
基于此，我们提出KLF5-ANXA1-FPR2轴维持输尿管稳态。免疫荧光分析揭示了KLF5和ANXA1在上皮细胞中的时空共表达，以及ANXA1与FPR2在成纤维细胞中的共表达。值得注意的是，与对照组相比，KLF5-ANXA1-FPR2轴在输尿管狭窄组织中的表达显著下调，表明该信号模块在狭窄发病机制中失调。因此，我们推测ANXA1-FPR2信号轴的功能障碍损害了上皮细胞介导的成纤维细胞稳态调节，导致异常的肌成纤维细胞活化，并为输尿管纤维化进展提供了分子机制。在治疗上，通过药物恢复ANXA1-FPR2信号传导，是抑制成纤维细胞过度活化和减轻纤维化诱导的US的一种有前景的策略。这一假说不仅阐明了输尿管纤维化的分子机制，也识别了具有临床相关性的可转化干预靶点。
尽管有这些发现，本研究也存在一些局限性。首先，有限的样本量（狭窄组n=7）使我们无法进行高级统计以调整潜在的混杂因素。其次，虽然本研究通过scRNA-seq和组织学分析识别了KLF5-ANXA1-FPR2轴，但未进行体外共培养实验来明确确立上皮来源的ANXA1对成纤维细胞行为的功能性影响。尽管我们的发现得到了其他组织现有文献的支持，但仍需进一步的功能验证来确认这些机制在输尿管纤维化背景下的作用。一旦获得必要资源，更大规模的队列研究和整合的体外/体内实验将是我们未来研究的重点。
结论
我们的研究结果表明，上皮细胞功能受损以及上皮细胞与成纤维细胞间通讯减少，与输尿管纤维化的进展密切相关或促成了其进展。具体而言，ANXA1-FPR2信号轴的功能障碍破坏了成纤维细胞的稳态，导致其异常活化和细胞外基质沉积。这些见解可能为US的药物管理提供新的治疗途径。
