可规模化的三维免疫活性神经球模型：探索神经炎症与脑部疾病的新平台

《Frontiers in Immunology》：A cell line–derived, immune-competent neurospheroid model to study neuroinflammation and human brain disorders

这篇文章介绍了一种创新、可扩展、重复性高的三维人源神经球（tri-hNSPHs）模型，该模型由神经元（SH-SY5Y）、星形胶质细胞（U138 MG）和小胶质细胞（HMC-3）三种细胞系快速自组装形成。它克服了传统二维（2D）培养和iPSC衍生脑类器官在模拟神经免疫互作方面的局限性，为在可控条件下研究神经炎症通路、氧应激反应以及高通量筛选抗炎药物（如地塞米松、米诺环素）提供了一个强大的实验平台，是连接简化模型与复杂类器官系统之间的实用桥梁。

　　

引言：模拟神经免疫系统的挑战与需求

在体外复现人类中枢神经系统（CNS）的复杂性是一个巨大的挑战。传统的二维细胞培养无法模拟体内的细胞空间组织结构，而诱导多能干细胞（iPSC）衍生的三维脑类器官虽然能提供更高的生理相关性，但其制备过程漫长、成本高昂、批次间差异大，限制了其在转化神经免疫学，特别是高通量药物筛选中的应用。因此，开发一种可扩展、重复性高且能精确模拟神经炎症等病理过程的实验平台显得尤为迫切。

神经元样细胞与星形胶质样细胞的分化

研究人员首先对两种人源细胞系进行了分化处理。将神经母细胞瘤来源的SH-SY5Y细胞用全反式维甲酸（ATRA）处理，成功诱导分化为神经元样细胞（NLCs）。分化后的细胞形态转变为具有球形胞体和细长轴突样突起的神经元样表型，免疫荧光显示β3-微管蛋白表达显著升高，而神经前体细胞标志物巢蛋白（Nestin）表达下降，同时神经发生相关转录因子（Mash1, NeuroD1, Nurr1）的mRNA水平也显著下调，证实了其向更成熟神经元表型的转变。

同时，将胶质母细胞瘤来源的U138 MG细胞用丁酸钠（NaB）处理，成功分化为星形胶质样细胞（ALCs）。分化后的细胞高表达星形胶质细胞标志物S100B，并且其增殖能力（通过EdU掺入实验检测）相较于未分化的肿瘤细胞显著降低，表现出更接近生理状态的特性。

二维细胞对促炎刺激的应答

在构建三维模型前，研究验证了ALCs和小胶质细胞系HMC-3在二维培养中对促炎刺激的应答能力。用细胞因子混合物（IL-1β, TNFα, IFNγ）刺激72小时后，ALCs中一系列与反应性星形胶质细胞表型相关的促炎标志物（如C3, GBP2, SERPING1等）和转录因子（STAT3, NF-κB）的mRNA表达均显著上调。同样，HMC-3细胞中与微胶质细胞激活相关的基因（如IL-8, MMP3, NLRP3, CCL20等）也大多显著增加。这证实了所选细胞系具备在炎症环境下发生功能转换的能力，为后续三维模型的构建奠定了基础。

三维免疫活性神经球（hNSPHs）的构建与表征

基于分化后的细胞，研究团队开发了两种三维模型。首先是双组分神经球（bi-hNSPHs），由SH-SY5Y和U138 MG细胞按1:1比例混合，在含有甲基纤维素的培养基中动态培养。细胞在48小时内开始自组装，并在14天内形成直径约550微米的球体。组织学（H&E）染色显示其内部具有双层结构：一个由ALCs组成的致密核心，被一层较疏松的、主要由NLCs组成的周边区域所包围。免疫荧光进一步确认了细胞类型的空间分布，并发现靠近核心的神经元更多表达巢蛋白（不成熟），而外周的神经元则高表达突触素（Synapsin）和微管相关蛋白2（MAP2）（更成熟）。

接着，团队引入了小胶质细胞系HMC-3，构建了更复杂的三组分神经球模型（tri-hNSPHs）。三种细胞（神经元:星形胶质细胞:小胶质细胞）按1:2:4的比例混合培养。该模型在14天内形成了形态更规则、边界更光滑的球体，平均直径同样增长至约550微米。活死染色显示，在第14天时，球体外层细胞活力高达94%。随时间推移的免疫荧光分析揭示了有趣的自组织过程：培养初期，球体核心主要由ALCs占据；随着时间发展，神经元组分不断向外扩张，而小胶质细胞（标志物Iba-1）则从最初局限于核心逐渐迁移并遍布整个球体。此外，神经元成熟标志物（Synapsin, MAP2）在远端区域高表达，而小胶质细胞也保留了其抗原呈递功能，高表达HLA-DR。这些结果表明，tri-hNSPHs不仅能自发形成有序的空间结构，还能支持细胞在三维环境中进一步成熟和功能化。

tri-hNSPHs在神经炎症建模与药物筛选中的应用

为了验证该模型在病理研究中的实用性，研究人员用相同的促炎细胞因子混合物（IL-1β, TNFα, IFNγ）刺激成熟的tri-hNSPHs。刺激成功引发了强烈的炎症反应，表现为上清液中多种炎症介质（IL-6, IL-8, IL-1β, CXCL10, CCL2, CCL5, PGE₂）的分泌显著增加。

随后，研究评估了三种抗炎药物（地塞米松、布洛芬、米诺环素）的干预效果。结果显示：

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  地塞米松（糖皮质激素）效果最为显著，能有效抑制IL-6, IL-8, CCL2, CCL5和PGE₂的分泌，但其对IL-1β和CXCL10的分泌无显著影响。这与其通过抑制NF-κB通路发挥抗炎作用，但可能不直接影响JAK/STAT1通路（调控CXCL10）或NLRP3炎症小体（调控IL-1β成熟分泌）的机制相符。
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  米诺环素（具有抗炎作用的抗生素）也能显著降低IL-6, IL-8, CCL5和PGE₂的水平，但对CCL2无效，其整体抑制效力弱于地塞米松。这证实了微胶质细胞在模型炎症级联反应中的活跃作用。
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  布洛芬（非甾体抗炎药，NSAID）仅能抑制PGE₂（前列腺素E₂）的生成，这是其作为环氧合酶（COX）抑制剂的预期效果，但对其他细胞因子无抑制作用，甚至轻微提升了IL-8和CCL5的水平。

这些结果证明了tri-hNSPHs能够区分不同作用机制的抗炎药物，是一个可用于高通量药物筛选的有效平台。

tri-hNSPHs模拟缺氧应激反应

除了神经炎症，研究还证明该模型适用于模拟其他脑病理过程，如缺氧（见于缺血性中风）。通过化学方法（氯化钴，CoCl₂）或物理方法（在1% O₂培养箱中培养）诱导缺氧，均能成功激活tri-hNSPHs中的缺氧应答通路。两种处理均导致缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）蛋白稳定并发生核转位，尤其是CoCl₂处理组效果更强。同时，HIF-1α的下游靶基因，如血红素加氧酶1（HMOX1）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）、丙酮酸脱氢酶激酶1（PDK1）和乳酸脱氢酶A（LDHA）的mRNA表达均显著上调。此外，模型上清液中VEGF蛋白的分泌也相应增加。这表明tri-hNSPHs具有完整的代谢和应激响应机制，能够模拟与缺氧相关的神经病理状态。

讨论与未来展望

本研究建立的三维免疫活性神经球模型，在实验可控性、可扩展性和重复性之间取得了良好平衡。它填补了简单二维培养与复杂iPSC类器官之间的技术空白，为研究神经炎症、缺氧应激及相关药物筛选提供了一个实用、高效且成本更低的平台。尽管基于细胞系的模型存在固有的遗传背景限制，无法完全模拟发育过程，但所选细胞系（SH-SY5Y, U138 MG, HMC-3）均经过长期广泛研究和表征，其稳定性和可重复性恰恰是进行机制研究和初步药物筛选的优势。

当然，该模型目前仍存在局限，例如缺少少突胶质细胞（影响髓鞘化研究）和内皮细胞（无法模拟血脑屏障）。未来，可以通过整合代表这些细胞类型的其他细胞系来进一步提升模型的复杂性和生理相关性。此外，利用SH-SY5Y细胞可分化为特定神经元亚型的能力，还可以构建区域特异性的疾病模型。总之，tri-hNSPHs作为一个强大的工具，有望推动神经免疫学研究及神经疾病治疗药物的临床前开发。