《Frontiers in Pharmacology》：Multifaceted modulation of human opioid receptors by kratom alkaloids: binding affinity, functional selectivity, and allosteric activity
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本文系统评估了卡痛叶(Mitragyna speciosa)中超过50种吲哚和氧化吲哚生物碱对人类μ-、κ-和δ-阿片受体(hMOR, hKOR, hDOR)的复杂调节作用。研究整合了放射性配体结合、cAMP抑制、β-arrestin2募集、[35S]GTPγS结合及分子对接等多种技术，首次揭示了包括epiallo-isopaynantheine、isopaynantheine、mitraciliatine、isospeciofoline在内的多种鲜为人知生物碱的药理特性，并首次实验证实speciophylline可作为人类MOR的G蛋白偏向性正性变构调节剂(PAM)。该研究不仅阐明了C15和C20位保守的药效团对受体亲和力与功能谱的调控作用，还为开发具有改良治疗前景的阿片类镇痛药提供了多样化的天然产物模板。
引言
卡痛叶(Mitragyna speciosa)是一种原产于东南亚的热带树木，其叶片传统上被用于缓解疲劳、提高耐力，并在高剂量下产生类似阿片的镇痛、止咳、止泻和抗炎作用。近年来，其使用已全球性扩张，既用于消遣，也作为自我管理的阿片依赖管理策略。然而，关于其不良反应、依赖性和罕见致死病例的证据不断积累，凸显了明确其分子作用机制的必要性。卡痛叶含有超过50种生物碱，包括吲哚和氧化吲哚两类，其组成因品种和栽培地区而异，这可能导致其主观效应的差异，也强调了需要进行综合药理学和植物学研究以阐明其多方面的生物活性。
卡痛叶的主要吲哚生物碱帽柱木碱(MG)及其氧化代谢产物7-羟基帽柱木碱(7-HMG)是μ-阿片受体(MOR)的部分激动剂，并不同程度地与δ-(DOR)和κ-阿片受体(KOR)相互作用。临床前研究中，7-HMG显示出比MG高得多的MOR亲和力和镇痛效力，其效力约为吗啡的10倍。值得注意的是，MG和7-HMG在MOR处均表现出G蛋白偏向性激动作用，即优先激活G蛋白通路而非β-arrestin募集，这种信号特征被认为可能带来改善的治疗结果。然而，信号偏向性与治疗结果之间的关系比最初提出的更为复杂。此外，物种间药理学差异显著，例如MG在人类MOR (hMOR)上是部分激动剂，但在小鼠MOR (mMOR)上是竞争性拮抗剂，这突出了使用人类阿片受体模型评估卡痛叶生物碱的至关重要性。
尽管对卡痛叶主要生物碱的研究日益增多，但在人类阿片受体亚型上对吲哚和氧化吲哚生物碱的系统性评估仍然缺乏。本研究旨在通过对hMOR、hKOR和hDOR的结合亲和力和功能活性进行综合评估，阐明其受体选择性、信号偏向性和结构-活性关系，并探索潜在的变构活性。
材料与方法
化合物
测试的吲哚和氧化吲哚生物碱通过分离、半合成或商业购买获得。包括帽柱木碱(MG)、speciociliatine、7-羟基帽柱木碱(7-HMG)等。参考化合物（如DAMGO、DPDPE、纳洛酮、芬太尼、吗啡等）购自商业来源。放射性配体[3H]-DAMGO、[3H]-Deltorphin II和[3H]-U-69,593用于结合实验。
竞争性放射性配体结合实验
使用稳定表达hMOR、hDOR和hKOR的CHO-K1细胞膜进行实验。通过计算放射性标记化合物的置换百分比来确定各化合物的Ki值。
功能活性测定
- 1.
cAMP积累测定：作为受体激活的主要功能筛选方法，基于酶片段互补(EFC)技术，测定化合物对福斯高林刺激的cAMP积累的抑制。
- 2.
β-arrestin-2募集测定：对在cAMP测定中显示阳性抑制的化合物，进一步评估其抑制福斯高林刺激的β-arrestin2募集的能力，以辅助评估配体偏向活性。
- 3.
[35S]GTPγS结合测定：基于mitraciliatine和isopaynantheine在cAMP测定中观察到的混合激动剂-拮抗剂谱，选择其进行[35S]GTPγS结合评估。
计算机分子对接
使用人类MOR与帽柱木碱假吲哚(PDB: 7T2G)的冷冻电镜结构进行激动剂和部分激动剂的对接，使用小鼠MOR的非活性状态晶体结构(PDB: 4DKL)进行拮抗剂对接。使用AutoDock 4.2.6进行分子对接，分析蛋白质-配体相互作用。
数据分析和统计
所有浓度-响应数据使用GraphPad Prism进行分析。结合实验的Ki值通过Cheng-Prusoff方程从IC50值计算。功能测定的响应归一化为参考化合物。阳性变构调节(PAM)操作上定义为：(i)单独应用时缺乏内在激动剂活性，(ii)在cAMP测定中增强对亚最大(EC20)浓度正构激动剂的响应，和/或(iii)在放射性配体测定中增强正构激动剂结合。
结果
受体结合
通过竞争性放射性配体结合实验评估了选定的卡痛叶生物碱在hMOR、hKOR和hDOR的结合亲和力。在测试的吲哚生物碱中，7-HMG对hMOR表现出高亲和力(Ki = 15.1 ± 3.7 nM)，并且是唯一在所有三种阿片受体亚型上都有明显结合的唯一化合物。Speciociliatine也对hMOR显示出高亲和力。MG和speciogynine分别显示中度和弱hMOR亲和力。Isopaynantheine、epiallo-isopaynantheine和mitraciliatine在hMOR和hKOR上均表现出中度亲和力。N(4)-氧化物衍生物表现出改变的选择性谱。
在测试的氧化吲哚生物碱中，corynoxine A在hMOR上表现出所有测试生物碱中最高的亲和力(Ki = 5.4 ± 0.3 nM)。Corynoxine B和isospeciofoline表现出中度hMOR结合亲和力。Speciophylline (亦称Uncarine D)在任何受体上均未检测到正构结合，但以浓度依赖性方式增强了[3H]DAMGO在hMOR的结合，这与阳性变构调节一致。
功能测定
抑制福斯高林刺激的cAMP积累
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吲哚生物碱：7-HMG表现出最广泛的功能活性，是唯一在全部三种阿片受体亚型上具有可测量效力的卡痛叶生物碱。在hMOR，7-HMG作为高效价、完全效力的激动剂。Speciociliatine在hMOR作为具有中等效价的部分激动剂，在hKOR作为弱效价的部分激动剂。MG显示出与speciociliatine相似的谱，但在hKOR效力较低。Paynantheine和speciogynine在hMOR表现出弱效价和最小效力。三个吲哚生物碱，mitraciliatine、isopaynantheine和epiallo-isopaynantheine，在hMOR起拮抗剂作用。值得注意的是，mitraciliatine和isopaynantheine也在hKOR作为中等效价、完全效力的激动剂，代表了跨受体亚型的混合拮抗剂/激动剂谱。
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氧化吲哚生物碱：氧化吲哚生物碱显示出 predominantly hMOR-选择性的功能谱。Corynoxine A在hMOR作为效价最高的完全效力激动剂，其次是isospeciofoline和corynoxine B。
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Speciophylline的阳性变构调节：Speciophylline在cAMP测定中缺乏内在激动剂活性，但作为阳性变构调节剂(PAM)，增强了[3H]DAMGO结合，并以EC50= 27.1 ± 4.5 μM增强了甲硫氨酸脑啡肽(EC20= 0.66 nM)诱导的福斯高林刺激cAMP抑制。值得注意的是，speciophylline未能增强β-arrestin-2募集，表明其对G蛋白信号通路的选择性调节。这些结果表明，speciophylline在hMOR处作为G蛋白偏向性阳性变构调节剂起作用，且无直接正构结合，这是卡痛叶生物碱在人类阿片受体中首次实验证明的机制。
β-arrestin-2募集
大多数吲哚生物碱显示最小或无β-arrestin-2募集，与G蛋白偏向性信号传导一致。在hMOR，只有mitraciliatine和isopaynantheine显示出可测量的活性，作为具有中等效力的拮抗剂。7-HMG是唯一诱导β-arrestin-2募集的吲哚生物碱，仅在hDOR显示弱效价和部分效力，尽管其在所有三种受体上均显示cAMP激动剂活性。所有测试的氧化吲哚生物碱均未在hMOR、hKOR或hDOR诱导可测量的β-arrestin-2募集。这包括corynoxine A、corynoxine B和isospeciofoline，它们在cAMP测定中显示出有效的hMOR激动作用。尽管有强大的G蛋白介导的信号传导，但完全缺乏β-arrestin-2募集表明氧化吲哚类化合物存在显著的G蛋白偏向性，这将其与经典的阿片激动剂区分开来。
GTPγS结合
Mitraciliatine和isopaynantheine在hMOR表现出弱拮抗活性，效价低且为部分效力。相比之下，两种生物碱在hKOR均作为中等效价、完全效力的激动剂。这些数据表明，两种化合物都作为弱μ-阿片拮抗剂但中等κ-阿片激动剂，揭示了它们阿片受体谱的明显功能差异。
结构-活性关系(SAR)和对接分析
通过分子对接进一步研究了吲哚和氧化吲哚生物碱的结构-活性关系。
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吲哚生物碱：对接7-HMG揭示了与hMOR结合口袋的几个关键相互作用。MG相比7-HMG在hMOR亲和力上大约15倍的降低归因于与ASN124氢键的丢失。在MG中位置20氢的倒置（即从S到R）形成speciogynine，导致亲和力大约降低2倍。从C20乙基到乙烯的转变（即从mitraciliatine到isopaynantheine）对亲和力影响可忽略，但将C20倒回最佳pro-S构型，如在epiallo-isopaynantheine中，产生了另一种高亲和力吲哚。C3构型的变化显著影响了speciogynine等化合物在口袋中的拟合。
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氧化吲哚生物碱：氧化吲哚骨架具有更高的自由度，在立体化学反转时表现出更明显的构象变化，这与更大的亲和力波动相关。当两个或更多手性中心处于R构型时，亲和力几乎完全丧失。尽管氧吲哚核心存在差异，但位置15和20的亲和力数据在吲哚和氧化吲哚之间遵循相似的趋势，从而可以假设一个通用的SAR和药效团。
讨论
本研究提供了迄今为止对M. speciosa吲哚和氧化吲哚生物碱在hMOR、hKOR和hDOR上最全面的评估，整合了结合、功能和计算分析，以阐明其药理学多样性。我们的发现证实并扩展了MG和7-HMG的G蛋白偏向性激动剂谱，同时揭示了整个生物碱类别中意想不到的药理学多样性。
功能多样性和信号偏向性
在卡痛叶生物碱中观察到的主要功能谱——在hMOR的部分激动作用伴最小的β-arrestin-2募集——将先前对MG和7-HMG的发现扩展到结构多样的一组吲哚和氧化吲哚生物碱。这种G蛋白信号偏向性将卡痛叶生物碱与吗啡和芬太尼等强烈募集β-arrestin-2的经典阿片类药物区分开来。除了确认偏向性激动作用，我们的功能表征揭示了意想不到的药理学多样性。Mitraciliatine和isopaynantheine表现出混合谱——在hMOR的拮抗作用与在hKOR的中等激动作用相结合。大多数氧化吲哚生物碱，特别是corynoxine A、corynoxine B和isospeciofoline，显示出有效的hMOR激动作用，但完全缺乏β-arrestin-2募集，代表了一种极端的G蛋白偏向性形式。
Speciophylline独特的阳性变构调节作用提供了一种机制上不同的阿片受体调节方法。通过增强内源性阿片信号而不直接激活受体，speciophylline与本研究中对其他吲哚和氧化吲哚生物碱观察到的正构激动剂和拮抗剂谱形成对比。总的来说，这些发现强调，卡痛叶复杂的药理学源于具有不同受体选择性、效力和信号偏向性的生物碱的联合作用，而非单一的支配性机制。
结构-活性关系
观察到的跨吲哚和氧化吲哚系列的结构-活性关系得到了在激动剂结合的hMOR晶体结构中分子对接的支持。尽管氧吲哚核心存在差异，但在位置15和20的亲和力数据在吲哚和氧化吲哚之间遵循相似的趋势，从而可以假设一个通用的药效团。关键的结构决定因素包括：位置四的碱性氮（与ASP147的离子相互作用），位置15和20容纳疏水子口袋中的必需烷基链（C15甲基丙烯酸酯，C20乙基/乙烯为优，pro-S构型最优），以及位置三显示立体化学偏好（S为优但非必需）。这个药效团框架适用于吲哚和氧化吲哚生物碱系列。
这项在人类阿片受体上的系统性表征揭示了一类药理学多样且结构可调的天然产物，具有作为开发具有改进治疗前景的阿片类镇痛药模板的潜力。
