《Frontiers in Plant Science》：Genome-wide identification and expression analysis of the CCT gene family reveals its function in regulating heading date in proso millet (Panicum miliaceum L.)
编辑推荐：
本文首次在糜子（Panicum miliaceum L.）中系统鉴定了74个CCT家族基因，通过整合多组学与表达分析，筛选出10个在短日照（SD）诱导抽穗期转换过程中动态上调的候选标记基因，为解析糜子光周期调控抽穗期的分子机制提供了关键靶点与理论依据，有助于其分子育种与适应性改良。
糜子CCT基因家族的全基因组鉴定、进化与功能分析
1. 引言
糜子是一种营养价值高、在光周期敏感的短日作物，其抽穗期是决定产量与地理适应性的关键农艺性状。植物光周期开花途径是一个复杂而保守的调控网络，其中CCT（CONSTANS, CONSTANS-LIKE, TOC1）基因家族扮演着核心角色。该家族成员通常包含一个或多个特征结构域，可被分为COL-like、CMF-like、PRR-like和TIFY-like四个亚家族。在拟南芥和水稻中，CCT家族基因（如CO、Hd1、Ghd7等）已被证实是开花时间的关键调控因子。然而，关于糜子CCT基因家族的系统性研究此前尚未见报道。作为一个异源四倍体作物，糜子复杂的基因组背景可能使其CCT基因家族在拷贝数、结构和功能上更具多样性与复杂性。因此，本研究旨在对糜子CCT基因家族进行首次全基因组鉴定与系统分析，以阐明其在光周期介导的抽穗期调控中的潜在功能。
2. 材料与方法
本研究选取了对光周期敏感的糜子品种龙糜4号，以及对光周期不敏感的材料0016和0053。植株在人工气候室中培养，设置了长日照（LD，18小时光照/6小时黑暗）和短日照（SD，12小时光照/12小时黑暗）两种光周期处理。
研究人员从糜子基因组数据库中，利用CCT结构域的隐马尔可夫模型（HMM）谱图，共鉴定出74个非冗余的PmCCT基因。通过生物信息学工具分析了这些基因的系统进化关系、基因结构、保守基序、染色体分布、复制事件及物种间共线性。表达分析分为三个部分：利用已发表的公共RNA-seq数据集分析了PmCCT基因在根、茎、叶、穗等10个不同组织中的表达谱；对SD处理下龙糜4号的叶片和茎尖分生组织（SAM）进行了转录组测序，分析了基因表达变化；并通过qRT-PCR在三个不同抽穗期的糜子种质中验证了候选基因的表达模式，所用内参基因为PmActin。
3. 结果
3.1 PmCCT基因家族的鉴定与染色体分布
在糜子中共鉴定出74个PmCCT基因（PmCCT1–PmCCT74），它们不均匀地分布在18条染色体上，其中4号染色体上的成员最多（11个）。
3.2 系统进化分析
基于糜子、拟南芥、水稻和谷子CCT蛋白全长序列构建的系统进化树将基因分为四个主要亚家族：COL-like、CMF-like、PRR-like和TIFY-like。其中，糜子的74个成员中，29个属于COL-like亚家族，22个属于CMF-like，13个属于TIFY-like，10个属于PRR-like。
3.3 基因结构与保守基序
基因结构分析显示，大部分PmCCT基因含有内含子，仅PmCCT24和PmCCT73完全不含内含子。保守基序分析共鉴定出10个保守基序，其分布具有明显的进化枝特异性。
3.4 复制与共线性分析
在糜子基因组内共鉴定出58个重复的PmCCT基因对，其中56个为片段重复，2个为串联重复。所有重复基因对的Ka/Ks比值均小于1，表明它们经历了纯化选择。种内共线性分析显示，6号染色体上的共线性基因对密度最高。种间比较显示，糜子与拟南芥、水稻、谷子分别存在17、164和175对共线性基因对，其中与同为禾本科的谷子共线性最高。
3.5 PmCCT基因的表达谱分析
转录组分析发现，SD处理诱导了叶片中44个PmCCT基因和SAM中56个PmCCT基因的差异表达。整合公共多组织表达数据，筛选出在叶片或小穗中高表达（表达量在所有10个组织中排名前三）的基因。最终，通过交集分析锁定了17个既响应光周期变化（在叶片或SAM中差异表达），又在抽穗相关组织（叶片或小穗）中高表达的候选PmCCT基因，包括PmCCT1, PmCCT2, PmCCT6等。
3.6 RNA-seq数据的qRT-PCR验证
使用与转录组测序相同的RNA样本（龙糜4号在SD处理下S0、S5、S10时间点的叶片和SAM），对上述17个候选基因进行qRT-PCR验证。结果显示，所有基因在两种组织中的表达趋势均与RNA-seq数据一致，证实了测序数据的可靠性。
3.7 鉴定与抽穗转换相关的PmCCT标记基因
在持续SD条件下，对光周期敏感品种龙糜4号和对光周期不敏感材料0016、0053，在抽穗前（21天）和抽穗期（28天）进行了qRT-PCR分析。根据表达动态，最终筛选出10个在龙糜4号抽穗转换期间（从21天到28天）特异性上调，而在不敏感材料中变化不显著的候选标记基因，它们是：PmCCT6, PmCCT19, PmCCT21, PmCCT22, PmCCT24, PmCCT29, PmCCT36, PmCCT59, PmCCT62和PmCCT63。其中，PmCCT19, PmCCT21, PmCCT36, PmCCT62, PmCCT63属于CMF亚家族；PmCCT6, PmCCT22, PmCCT29, PmCCT59属于COL亚家族；PmCCT24属于TIFY亚家族。
4. 讨论
本研究首次在糜子中完成了CCT基因家族的全基因组系统性分析。鉴定出的74个PmCCT基因数量显著多于拟南芥、水稻、谷子等二倍体物种，这很可能与糜子的异源四倍体属性有关。片段重复是驱动该家族扩张的主要机制，所有重复基因对均受到强烈的纯化选择。与谷子之间广泛的共线性关系，反映了禾本科作物CCT基因家族保守的进化框架。
表达分析揭示了PmCCT基因响应光周期和组织特异性的复杂调控模式。最终筛选出的10个候选标记基因，其表达动态与光周期敏感品种的抽穗事件紧密相关，为解析糜子光周期调控抽穗的分子网络提供了关键切入点。其中，PmCCT19是唯一一个在转录组数据中于叶片和SAM中均被SD持续上调的基因，提示了其可能具有独特的功能。这些基因来自CMF、COL和TIFY多个亚家族，凸显了糜子抽穗期调控网络的复杂性。
综上所述，该研究不仅阐明了糜子CCT基因家族的分子特征与光周期响应表达模式，更重要的是鉴定出了一组与抽穗期密切相关的候选标记基因。这些发现为通过分子育种手段改良糜子抽穗期、优化其地理适应性、扩大种植范围提供了宝贵的遗传资源和理论依据。
