《Frontiers in Pain Research》：Artemin/GFRA3 axis and TRP channels: molecular insights from a feline model of osteoarthritis
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本文通过钙成像、qRT-PCR及ELISA等技术，首次在猫背根神经节（DRG）中系统验证了TRPV1、TRPA1、TRPM8等疼痛相关瞬时受体电位（TRP）通道的功能表达，并揭示了Artemin/GFRA3轴与影像学退行性关节病（DJD）评分的显著相关性，为猫乃至人类骨关节炎（OA）慢性疼痛的机制研究与靶向治疗提供了新视角。
引言
退行性关节病（DJD），即骨关节炎（OA），在猫中的发病率超过90%，是导致其活动能力下降、行为改变及疼痛的主要原因，且与人类DJD的病因高度相似。尽管疼痛普遍存在，但目前缺乏针对猫DJD相关疼痛的有效疗法。在哺乳动物中，伤害性感受依赖于多种瞬时受体电位（TRP）离子通道，例如TRPV1、TRPV2、TRPM3负责检测伤害性热刺激，TRPM8和TRPA1负责检测伤害性冷刺激，TRPV4则检测渗透压和压力变化。此外，伤害性机械痛由Mas相关G蛋白受体D（MRGPRD）介导，而P物质（Tac1）则负责将疼痛信号从DRG神经元传递至脊髓中间神经元。
先前研究表明，胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）家族受体α-3（GFRA3）及其配体Artemin可能在骨关节炎疼痛中扮演关键角色。GFRA3在小鼠约20%的DRG神经元中表达，并与TRPA1、TRPV1、TRPM8等通道共定位。Artemin与GFRA3结合后可导致感觉神经元致敏。然而，这些通路在猫DJD中的作用缺乏直接证据，本研究旨在填补这一空白。
材料与方法
研究使用了来自北卡罗来纳州立大学转化疼痛研究项目此前收集的样本和数据。通过猫肌肉骨骼疼痛指数评估疼痛评分，并通过影像学评估DJD评分。将猫分为健康组与DJD组。
研究采用多种实验方法：
- 1.
利用Fura-2钙成像技术，在健康猫的DRG神经元中验证TRPV1、TRPV2、TRPA1、TRPM8的功能表达。
- 2.
使用SYBR Green定量逆转录聚合酶链反应，比较健康猫与DJD猫DRG神经元中多种疼痛传感器基因的mRNA表达，包括TRPV1、TRPV2、TRPV4、TRPA1、TRPM3、TRPM8、MRGPRD、TAC1和GFRA3。
- 3.
采用酶联免疫吸附试验（ELISA）量化并比较健康猫与DJD猫的血清Artemin浓度。由于无猫特异性试剂盒，使用了与人Artemin有87.2%同源性的人类试剂盒，并通过中和实验验证了其特异性。
结果
健康猫DRG中TRP通道的功能表达
钙成像实验证实，健康猫DRG感觉神经元对特定激动剂有功能响应：约37.8%的神经元对辣椒素（TRPV1激动剂）有反应，15.9%对丙磺舒（TRPV2激动剂）有反应，6.5%对烯丙基异硫氰酸酯（AITC，TRPA1激动剂）有反应，14.4%对icilin（TRPM8激动剂）有反应。这首次直接证实了这些TRP通道在猫DRG中的功能存在。
健康猫与DJD猫之间的差异基因表达
qRT-PCR结果显示，在DJD猫的DRG中，TRPV1、TRPV2和TRPM8的mRNA表达呈现出大于1.5倍的增加趋势，而MRGPRD的mRNA表达则呈现出约1.5倍的降低趋势。然而，这些变化均未达到统计学显著性。Artemin的受体GFRA3在猫DRG中有表达，但其水平在DJD猫中未发生变化。
循环Artemin浓度与影像学DJD严重程度相关
血清Artemin浓度在DJD猫中显著高于健康猫。相关分析显示，血清Artemin浓度与影像学DJD评分之间存在显著但较弱的相关性，而与兽医疼痛评分之间无显著相关性。此外，血清Artemin浓度与年龄、体重、身体状况评分等均无显著相关性。
讨论
Artemin作为疾病严重程度的潜在生物标志物
本研究首次在猫中发现血清Artemin浓度与影像学DJD评分之间存在显著正相关，这与之前在大中的研究发现部分一致，提示Artemin可能作为关节退行性病变的潜在系统性生物标志物。然而，其与主观疼痛评分无关，表明Artemin可能更反映结构损伤而非疼痛感受本身。
猫DRG中TRP通道的比较功能表达与验证
研究确认了TRPV1、TRPA1、TRPM3、TRPM8等在猫DRG中的mRNA表达，其中TRPM3为首次在猫DRG中发现。尽管DJD猫中TRPV1、TRPV2、TRPM8的mRNA有上调趋势，TRPA1表达未增加，这与小鼠模型不同，提示物种特异性。MRGPRD的下调趋势可能是一种限制机械超敏的保护机制。功能钙成像证实了这些通道的活性，但猫DRG中对AITC（TRPA1激动剂）和丙磺舒（TRPV2激动剂）有反应的神经元比例低于小鼠，再次强调了物种差异。
物种特异性差异与逆向调节
与大鼠、小鼠的研究相比，猫DJD模型显示出独特的分子特征。例如，GFRA3的mRNA在DJD猫DRG中未上调，而在患骨关节炎的狗中则会上调。这些差异凸显了利用自然发生疾病的猫作为研究模型的独特价值，它能更好地反映人类OA的复杂性。
局限性与潜在混杂因素
本研究存在若干局限性，包括缺乏猫特异性的Artemin ELISA试剂盒、样本量相对较小、DJD组猫的年龄显著大于健康组，以及部分猫同时患有慢性肾病等共存疾病。这些因素可能对结果产生影响，未来需要更大规模的纵向研究加以验证。
结论
本研究为Artemin/GFRA3/TRP轴在猫退行性关节病慢性疼痛病理中的作用提供了机制性和系统性的证据。结果证实了TRP通道表达在猫中的保守性，并指出Artemin可作为影像学DJD严重程度的潜在生物标志物。这些发现验证了自然发生的猫DJD作为一种高度相关的转化模型用于骨关节炎研究的价值，并确定了这些上调的TRP通道作为开发有效镇痛疗法的有潜力的新靶点，对兽医和人类医学均具有重要意义。
