《Frontiers in Immunology》：Hsa-miR-99a deficiency contributes to MSI-H colorectal cancer progression by activating the mTOR pathway and inducing Th1/Th2 imbalance
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本研究深入探讨了microRNA hsa-miR-99a在结直肠癌（CRC）微卫星高度不稳定（MSI-H）亚型中的关键作用。研究发现，hsa-miR-99a在MSI-H型CRC中表达显著降低，其缺失会解除对mTOR通路基因（如ATP6V1G2和WNT6）的抑制，并重塑肿瘤免疫微环境，导致促炎的Th1细胞减少和免疫抑制性的Th2/Th17细胞增多，从而共同驱动MSI-H型CRC的进展。该研究为理解CRC亚型特异性分子机制提供了新见解，并提示hsa-miR-99a及其调控网络可作为潜在的治疗靶点。
引言
结直肠癌（CRC）是全球发病率和死亡率均位居前列的恶性肿瘤。根据微卫星不稳定性（MSI）状态，CRC可分为微卫星稳定（MSS）和微卫星高度不稳定（MSI-H）亚型，两者在基因特征、免疫浸润和治疗反应上存在显著差异。MSI-H型肿瘤通常对免疫检查点抑制剂敏感，而MSS型则反应不佳，因此亟需针对不同亚型开发新的治疗靶点。MicroRNAs（miRNAs）作为关键的转录后调控因子，在CRC发生发展中扮演重要角色。其中，hsa-miR-99a被报道在CRC中具有抑癌和促癌的双重功能，但其在CRC不同MSI亚型中的表达差异、具体调控网络以及对肿瘤免疫微环境（TIME）的影响尚不明确。本研究旨在通过整合生物信息学分析与实验验证，系统阐明hsa-miR-99a在CRC，尤其是MSI-H亚型中的功能和调控机制。
材料与方法
本研究从TCGA数据库获取了CRC的转录组数据和临床信息，将样本分为MSS组（n=421）和MSI-H组（n=81）进行比较分析。同时，从GEO数据库获取了单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集（GSE161277）。利用TargetScan和miRWalk数据库预测hsa-miR-99a的靶基因，并通过相关性分析筛选出关键基因。使用ssGSEA算法评估了24种免疫细胞在肿瘤中的浸润水平差异。通过单细胞数据分析解析了CRC肿瘤微环境中的细胞异质性。从KEGG数据库获取mTOR通路基因集，分析其与hsa-miR-99a表达的相关性。此外，研究收集了山西白求恩医院（Shanxi Bethune Hospital）2022年至2025年的CRC患者外周血和肿瘤组织样本，通过RT-qPCR、Western blot以及多重免疫组化（mIHC）结合酪胺信号放大（TSA）技术对关键发现进行了实验验证。
结果
3.1 hsa-miR-99a在MSS和MSI-H CRC中的差异表达及临床意义
分析显示，hsa-miR-99a在MSS肿瘤中的表达水平显著高于MSI-H肿瘤。这一趋势在研究者收集的临床队列中也得到验证。生存分析表明，hsa-miR-99a高表达的患者总生存期更差。此外，hsa-miR-99a的表达水平在不同年龄分组和T/N分期中也存在显著差异。
3.2 鉴定出受hsa-miR-99a调控的12个关键基因
通过数据库交叉和相关性分析，最终确定了12个与hsa-miR-99a表达显著相关（|r|>0.3， p<0.05）的关键靶基因，包括ATP2B2、ATP2B4、SLC8A1、KCNJ5、NTRK3、TNFRSF19、GHR、CXCL12、NTNG1、SDC2、SFRP1和PRICKLE2。功能富集分析显示这些基因主要富集于“钙信号通路”、“cGMP-PKG信号通路”等通路。
3.3 MSS与MSI-H CRC中不同的免疫细胞浸润景观
免疫浸润分析发现，MSS与MSI-H组之间在全部24种被分析的免疫细胞类型上均存在显著差异。其中，辅助性T细胞1（Th1）、Th17、Th2、效应记忆CD8+T细胞和γδ T细胞的浸润水平差异尤为明显。相关性分析显示，SDC2和hsa-miR-99a与自然杀伤（NK）细胞浸润呈最强正相关，而ATP2B4和hsa-miR-99a则与Th17细胞浸润呈最高负相关。
3.4 单细胞分析确定T细胞是CRC中的关键细胞群
对单细胞数据的分析将细胞分为上皮细胞、杯状细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞、成纤维细胞和肥大细胞等7种主要类型，其中T细胞在肿瘤微环境中占比最大。对T细胞的进一步亚群分析鉴定出CD8+T细胞、中央记忆T（Tcm）细胞、调节性T（Treg）细胞和NKT细胞四个亚型。在CRC样本中，CD8+T细胞和Treg细胞的比例显著高于对照样本。关键基因PRICKLE2和SLC8A1在T细胞中于CRC和对照样本间存在差异表达。细胞通讯分析表明，CRC微环境中所有主要细胞亚型之间的相互作用网络比正常组织更广泛。
3.5 hsa-miR-99a与CRC中mTOR通路活性相关
研究发现hsa-miR-99a的表达与10个mTOR通路相关基因（ATP6V1G2、WNT2、WNT6、WNT9A、WNT9B、FZD1、FZD4、FZD8、IGF1和AKT3）的表达高度相关。RT-qPCR验证显示，ATP6V1G2、WNT6、WNT9A、FZD1、FZD4和FZD8的mRNA水平在MSI-H组中显著高于MSS组。Western blot在蛋白水平上进一步证实，ATP6V1G2、WNT6和AKT3在MSI-H样本中表达上调。与此一致，mTOR关键激酶本身的蛋白水平在MSI-H组中也显著升高，提示该亚型中mTOR通路活性增强。
3.6 免疫分型揭示MSI-H CRC中存在免疫抑制性转变
基于免疫浸润分析的发现，研究通过mIHC技术对Th1、Th2和Th17细胞进行了原位表征。结果显示，在MSI-H CRC组织中，Th1细胞标志物（T-bet、IFN-γ和FOXP3）的表达相较于MSS组织显著降低。相反，Th2细胞标志物（GATA3、IRF4、IL-4和FOXP3）和Th17细胞标志物（IL-17、RORγt和FOXP3）在MSI-H组中显著升高。这表明MSI-H肿瘤的免疫环境呈现出一种“免疫抑制性转变”：促炎的、具有抗肿瘤活性的Th1反应受到抑制，而与体液免疫、促肿瘤生成相关的Th2反应以及常促进炎症和血管生成的Th17反应则相对富集。
讨论
本研究发现hsa-miR-99a在MSS型CRC中高表达，且与不良预后相关。鉴定出的12个关键靶基因中，如SDC2是CRC筛查的生物标志物，SFRP1是Wnt通路拮抗剂，它们在CRC中的作用已有报道，但它们与hsa-miR-99a的直接调控关系，尤其是在不同MSI亚型中的差异，是本研究的创新点。研究还首次揭示了hsa-miR-99a表达与mTOR通路活性在CRC（特别是MSI-H亚型）中的强正相关性。尽管hsa-miR-99a在其他语境中被报道抑制mTOR，但本研究在MSI-H CRC中发现了一种可能的正向调控环路或协调上调模式，提示了亚型特异性机制。在肿瘤免疫微环境方面，尽管MSI-H肿瘤通常浸润淋巴细胞更多，但本研究揭示了其内部向Th2/Th17主导的免疫抑制表型转变，这可能是其产生适应性免疫抵抗的机制之一，为未来针对Th2/Th17通路的联合免疫治疗提供了新思路。当然，本研究也存在一些局限，例如缺乏直接的分子互作功能验证（如荧光素酶报告基因实验），临床样本来自单中心等，这些将是后续深入研究的重点。
结论
综上所述，本研究全面解析了hsa-miR-99a在CRC中的多层面作用，连接了基因组调控、免疫微环境重塑和致癌通路激活。研究提出了一个以hsa-miR-99a为核心的新型调控网络，涉及SLC8A1、TNFRSF19等具有直接临床相关性的关键基因，并影响了免疫细胞动态。尤为重要的是，本研究在CRC中建立了hsa-miR-99a表达与mTOR通路活性之间的强关联，并确定ATP6V1G2和WNT6是MSI-H肿瘤中潜在的关键效应分子。这些发现将hsa-miR-99a及其下游靶点，特别是mTOR轴内的分子，定位为开发亚型特异性诊断生物标志物或治疗策略的有力候选者。
