《Journal of Advanced Research》：Smart nano-assembly from traditional Chinese medicine: manganese-enhanced polysaccharide platform for orchestrated cancer chemo-immunotherapy
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针对传统癌症疗法存在的毒性高、靶向性差、易耐药等难题，南开大学研究团队通过整合玉竹多糖（POP）、木犀草素（LUT）和锰离子（Mn2+），设计了一种pH响应的纳米组装体LUT@POP-FH-Mn。该体系在弱酸性肿瘤微环境中可特异性释放药物，通过化疗、化学动力学疗法（CDT）和免疫治疗三重协同机制，显著增强了抗肿瘤疗效，并展现了优异的生物安全性，为中药现代化和多功能纳米药物研发提供了创新策略。
癌症至今仍是全球健康的严峻挑战。尽管手术、化疗和放疗等常规手段能在一定程度上缓解症状，但它们仍普遍面临全身毒性大、靶向性不足、易产生耐药性以及难以控制转移和复发等难题。这些局限性往往导致临床疗效不尽如人意。为了突破瓶颈，开发兼具精准递送、多模式协同和低毒性的新型抗肿瘤策略已成为研究焦点。在这一背景下，与纳米药物递送系统（Nanodrug Delivery Systems, NDDS）相结合的联合疗法展现出巨大潜力。NDDS不仅能改善药物的溶解性、稳定性和循环时间，还能通过增强渗透与滞留（Enhanced Permeability and Retention, EPR）效应或主动靶向机制，实现药物在肿瘤部位的高效富集，为整合化疗、免疫治疗、光热治疗和化学动力学治疗（Chemodynamic Therapy, CDT）等多种模式提供了理想平台。
在众多治疗元素中，锰（Manganese）因其独特的生物学特性备受关注。作为一种必需微量元素，锰在癌症治疗中扮演双重角色：其一，Mn2+可通过类芬顿（Fenton-like）反应产生活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS），助力CDT；其二，它能激活cGAS-STING信号通路，促进I型干扰素产生和树突状细胞（Dendritic Cells, DCs）成熟，从而显著放大先天性和抗肿瘤免疫应答。这种CDT与免疫激活的协同作用，使得Mn2+成为联合治疗平台的理想候选者。然而，如何将其高效整合到生物相容性载体中，并确保其在肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）中实现响应性释放，仍是关键挑战。
与此同时，来源于中药的天然产物为癌症补充治疗提供了宝贵资源。其中，兼具免疫调节功能和理想NDDS支架潜力的多糖类成分尤为引人注目。玉竹（Polygonatum odoratum，中药名“玉竹”）是“药食同源”的典型代表，其富含的天然杂多糖（POP）具有显著的免疫刺激作用。而天然小分子木犀草素（Luteolin, LUT）作为一种广泛存在于中药、蔬菜和水果中的黄酮类化合物，是另一种“药食同源”的抗癌剂，能通过诱导内质网应激和线粒体功能障碍来升高肿瘤细胞内ROS水平，从而激活凋亡通路。然而，LUT的水溶性差、生物利用度低等问题限制了其临床转化。
基于此，南开大学的研究团队巧妙设计，将LUT的化疗活性、POP的免疫调节功能与Mn2+介导的CDT结合起来，构建了一种多功能协同抗肿瘤平台。相关研究成果发表在《Journal of Advanced Research》上。
为了开展这项研究，研究人员运用了几个关键技术方法：首先，从玉竹根茎中热水提取并纯化得到POP，并对其单糖组成和分子量进行化学分析。其次，设计并合成了具有pH响应性的交联分子FH，它通过酰腙键连接两个苯硼酸基团。接着，利用FH的硼酸基团与POP末端的顺式二醇形成pH敏感的硼酸酯键，同时其酰腙单元螯合Mn2+，从而制备出锰离子配位的多糖基载体POP-FH-Mn。最后，通过超声辅助自组装，将疏水性药物LUT装载到POP-FH-Mn中，形成最终的纳米组装体LUT@POP-FH-Mn。研究利用动态光散射、透射电镜、紫外-可见光谱、傅里叶变换红外光谱等手段对纳米粒的理化性质进行表征。体外抗肿瘤效果在A549和HeLa细胞系上评估，并利用斑马鱼异种移植模型进行体内药效评价。免疫刺激效果则在鼠源树突状细胞系DC2.4上通过检测细胞表面标志物（CD40, CD80, CD86, MHC-II）和NO释放来评估。此外，还通过分子动力学模拟从理论上揭示了纳米组装的分子间相互作用机制。
研究结果
1. 化学分析POP
对玉竹多糖（POP）的分析显示，其碳水化合物含量为96.8%，蛋白质含量为3.4%。单糖组成分析表明，POP由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖和果糖以特定摩尔比构成，其中果糖占比最高（59.4%）。通过凝胶渗透色谱法测得其重均分子量（Mw）为3.8 kDa。
2. 化学表征交联剂FH
根据合成路线成功制备了响应性交联剂FH，并通过核磁共振氢谱、碳谱、高分辨质谱和紫外光谱确认了其化学结构。与两种反应物4-FB和4-HB相比，FH在305 nm处出现特征吸收峰，这归因于其更大的共轭体系。
3. 表征天然产物纳米组装体系
成功制备了纳米组装体LUT@POP-FH-Mn。紫外和红外光谱证实了FH与POP的成功交联以及LUT的成功装载。动态光散射测量显示，LUT@POP-FH-Mn的水合粒径约为230.2 nm，分散均匀。透射电镜观察显示其为平均直径约170 nm的球形颗粒。LUT的药物负载量和包封率分别为5.1%和97%。
4. LUT@POP-FH-Mn的胶体稳定性和响应功能
LUT@POP-FH-Mn在4°C下储存30天粒径无显著变化，在不同生理介质中均表现出良好的胶体稳定性。在弱酸性条件下（pH 6.0和5.0），纳米粒的粒径显著增大，结构发生崩解。傅里叶变换红外和紫外光谱证实，酸性条件触发了FH中硼酸酯键和酰腙键的断裂。药物释放实验表明，在pH 7.4时LUT几乎不释放，而在pH 6.0和5.0时释放显著加速，表现出良好的pH响应性。
5. 自组装机制的计算机模拟分析
全原子分子动力学模拟揭示了LUT@POP-FH-Mn的自组装过程。模拟显示，LUT和POP-FH分子在模拟过程中自发聚集形成纳米团簇。范德华力是驱动组装过程的主要作用力。独立梯度模型分析进一步表明，LUT被包裹在POP-FH载体内部，FH连接体的共轭结构与LUT的芳香环之间存在明显的π-π堆积相互作用，同时LUT的羰基和羟基与POP的羟基之间形成多个氢键。
6. 体外·OH生成分析
通过监测亚甲基蓝的降解和电子自旋共振波谱分析，证实POP-FH-Mn能有效催化H2O2分解，通过类芬顿反应产生具有细胞毒性的羟基自由基（·OH），且其生成能力具有浓度和时间依赖性。
7. 生物相容性评估
响应性连接剂FH在测试浓度范围内对人肾上皮细胞（HEK293T）无显著毒性。斑马鱼胚胎实验表明，暴露于不同浓度的LUT@POP-FH-Mn 48小时后，胚胎存活率为100%，且孵化后的幼鱼形态发育正常，表明该纳米体系具有优异的生物相容性。
8. LUT@POP-FH-Mn增强的抗肿瘤功效
体外细胞实验显示，与游离LUT和空白载体POP-FH-Mn相比，LUT@POP-FH-Mn对A549和HeLa细胞表现出显著增强的抗增殖活性，其半数抑制浓度（IC50）值分别降低至0.22 μg/mL和0.98 μg/mL。在斑马鱼异种移植模型中，LUT@POP-FH-Mn能剂量依赖性地抑制肿瘤生长和迁移，其效果显著优于同等剂量的游离LUT。
9. 介导肿瘤细胞氧化应激和凋亡
流式细胞术分析显示，LUT@POP-FH-Mn处理能剂量依赖性地显著提升A549细胞内的ROS水平和脂质过氧化水平。同时，该处理可有效诱导肿瘤细胞凋亡，凋亡细胞比例随剂量增加而升高。这表明LUT@POP-FH-Mn通过化疗和CDT的联合作用，激活氧化应激、损伤脂质膜并诱导细胞凋亡。
10. POP-FH-Mn的免疫增强激活作用
在DC2.4细胞上的评估表明，POP-FH-Mn能剂量依赖性地促进树突状细胞释放一氧化氮（NO），并上调其表面共刺激分子（CD40, CD80, CD86）和主要组织相容性复合体II类分子（MHC-II）的表达。值得注意的是，在相同POP含量下，POP-FH-Mn对CD40、CD80和MHC-II的上调作用显著强于POP单独处理，这可能是Mn2+与POP协同激活DCs的结果。
研究结论与讨论
本研究成功构建了LUT@POP-FH-Mn纳米组装体，它整合了天然活性分子LUT和POP，以及CDT催化剂Mn2+，形成了一个集化疗、免疫治疗和CDT于一体的协同抗肿瘤NDDS。该研究的设计具有多重创新优势：首先，采用具有生物活性的天然多糖POP作为载体骨架，避免了合成材料的潜在毒性风险，符合绿色医药理念。其次，创新性地设计了具有双重pH响应机制的交联分子FH，赋予纳米体系在弱酸性肿瘤微环境中智能控释药物的能力。再者，通过分子间π-π堆积、氢键等弱相互作用驱动的高效自组装，实现了LUT的高负载。
该纳米体系展现出三重协同抗肿瘤机制：1) LUT通过诱导细胞内氧化应激和介导细胞凋亡直接杀伤肿瘤细胞；2) Mn2+通过类芬顿反应催化产生·OH，引发肿瘤细胞脂质过氧化，增强抗肿瘤效果，且其在弱酸性环境中的催化适应性优于传统的Fe2+体系；3) POP不仅作为载体框架，还能作为温和的免疫佐剂激活DCs，这一免疫刺激作用在与Mn2+协同下得到进一步放大，共同上调DCs表面的共刺激分子和抗原呈递分子，从而启动和强化抗肿瘤免疫应答。
综上所述，LUT@POP-FH-Mn充分利用了天然产物的独特生物活性和多模式联合治疗的协同效应，为癌症治疗提供了一种有前景的新策略，同时也为中药资源在现代纳米医学中的开发与应用开辟了新途径。本研究所用原料均为药食同源材料，具有成本低、来源广、制备工艺简单可控等优点，显示出较强的工业化放大潜力。然而，当前研究仍存在一定局限性，例如体内抗肿瘤评价仅基于斑马鱼模型，缺乏在哺乳动物模型中的系统验证；对系统在体内的药代动力学、分布、代谢途径及长期安全性需进一步探究；免疫治疗功效的评估主要依赖于体外DCs激活实验，缺乏对体内免疫微环境的全面评估。未来的研究应聚焦于在哺乳动物模型中开展系统的临床前评价，并深入探索锰离子激活cGAS-STING通路与POP协同增强抗肿瘤免疫治疗的综合机制，以推动这一创新治疗策略向临床应用的全面转化。
