大肠杆菌中D-乳酸驱动赖氨酸D-乳酸化调控代谢的机制研究

《Journal of Biological Chemistry》：D-lactate Drives Lysine D-lactylation to Regulate Metabolism in Escherichia coli

本研究为阐明乳酸旋光异构体在翻译后修饰中的功能差异，以原核生物大肠杆菌为模型，首次报道了由D-乳酸驱动的赖氨酸D-乳酸化(KD-la)是一种全新的翻译后修饰(PTM)。研究揭示了乙酸辅酶A转移酶(YdiF)催化生成D-乳酸辅酶A(D-lactyl-CoA)是连接D-乳酸与KD-la的关键步骤，鉴定出71个蛋白上的86个KD-la位点，并发现厌氧条件可通过增强糖酵解、促进乳酸脱氢酶LdhA产生D-乳酸，进而提升KD-la水平。研究还证实CobB是一种内源性去D-乳酸化酶，并发现GapA蛋白K257位点的D-乳酸化可调控细菌生长。该工作为理解原核生物中手性代谢物的非代谢功能及其在代谢适应中的调控作用提供了新见解。

　　

你是否想过，构成生命体的分子也像我们的双手一样，有“左手”和“右手”之分？这种被称为“手性”的特性，在生命活动中扮演着至关重要的角色。以乳酸为例，这个我们在剧烈运动后肌肉中大量积累的分子，就存在L-型和D-型两种对映体。长久以来，科学家们知道，在真核生物（包括我们人类）中，L-乳酸占绝对主导，它不仅是一种能量代谢的产物，更能作为一种信号分子，通过一种名为“赖氨酸L-乳酸化(K_L-la)”的蛋白质翻译后修饰，广泛参与基因表达调控、免疫应答乃至癌症发生等过程，掀起了代谢与表观遗传交叉研究的热潮。

然而，在生命世界的另一大分支——原核生物（如细菌）中，情况则有所不同。许多细菌能同时产生并积累L-乳酸和D-乳酸。尽管已知D-乳酸是细菌糖酵解的重要终产物之一，但其是否也像L-乳酸一样，能够超越能量代谢的角色，通过驱动类似的蛋白质修饰来行使调控功能，一直是个未解之谜。尤其是在人体肠道等复杂微环境中，细菌产生的D-乳酸可能作为跨界信号分子影响宿主健康，但其背后的分子机制更是迷雾重重。解开D-乳酸在原核生物中的“非代谢”功能，对于理解细菌自身的代谢适应、微生物与宿主的相互作用乃至开发新的调控策略，都具有重要意义。

为了回答这一系列问题，以张建继、张凯等研究人员为主力的中国天津医科大学团队，在《Journal of Biological Chemistry》上发表了一项突破性研究。他们独辟蹊径，以经典的模式生物大肠杆菌为“侦察兵”，深入探究了D-乳酸是否以及如何驱动蛋白质修饰。他们的研究发现，D-乳酸驱动的赖氨酸D-乳酸化(K_D-la)在大肠杆菌中真实存在，并且是一种动态的、可调控的翻译后修饰系统。具体而言，乙酸辅酶A转移酶YdiF被证明是催化生成关键修饰供体D-乳酸辅酶A的“启动器”，成功将D-乳酸代谢与蛋白质修饰桥接起来。通过高精度的质谱分析，他们绘制了首张大肠杆菌D-乳酸化修饰图谱，鉴定了71个蛋白上的86个修饰位点，这些蛋白显著富集于糖酵解、氨基酸合成等核心代谢通路。有趣的是，当细菌处于缺氧压力下时，会启动“无氧酵解”模式，产生大量的D-乳酸，从而导致全局性的K_D-la水平升高，这提示K_D-la可能是细菌感应和适应缺氧环境的一个代谢“传感器”。研究还发现了这个修饰系统的“橡皮擦”——去乙酰化酶CobB同样能够高效去除D-乳酸化修饰。更关键的功能实验表明，糖酵解关键酶GapA第257位赖氨酸的D-乳酸化会抑制该酶活性，进而减缓细菌生长，而CobB可以通过擦除这个位置的修饰来逆转这一效应。这项研究首次系统揭示了D-乳酸通过驱动蛋白质D-乳酸化修饰，在原核生物中扮演着超越能量载体的精细化调控角色，为理解手性代谢物的生物学功能开辟了全新视角。

为了完成这项研究，作者们综合运用了多项关键生命科学技术。首先，他们利用了基因敲除与过表达菌株（来自Keio单基因敲除库及自行构建），结合蛋白质免疫印迹(Western blot)，在体内验证了K_D-la的存在及其对D-乳酸、相关酶(YdiF, LdhA, CobB)的响应。其次，通过体外酶活实验与高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS) 分析，证实了YdiF催化生成D-乳酸辅酶A的活性。再者，他们采用基于特异性抗体免疫亲和富集结合纳米液相色谱-串联质谱(nano-HPLC-MS/MS) 的修饰组学技术，大规模鉴定并验证了D-乳酸化修饰位点。最后，通过体外去修饰实验、酶活测定以及细菌生长曲线分析，阐明了特定修饰位点（GapA K257）的生物学功能及CobB的调控作用。

1. 大肠杆菌中赖氨酸D-乳酸化的存在

研究人员首先检测到大肠杆菌在厌氧条件下能产生超过3 mM的D-乳酸，而在有氧条件下几乎检测不到。使用泛D-乳酸化抗体进行蛋白质免疫印迹分析，发现K_D-la在多种生物中存在，且在大肠杆菌和奇异变形杆菌中水平显著高于人宫颈癌细胞(HeLa)和鼠李糖乳杆菌(LGG)。此外，在培养基中外源添加D-乳酸能以剂量依赖的方式显著增强大肠杆菌全细胞裂解液中的K_D-la水平，而K_L-la水平无显著变化，这初步证明了D-乳酸是K_D-la的关键决定因素。

2. YdiF作为D-乳酸辅酶A转移酶

为了探究K_D-la的形成机制，研究人员将纯化的YdiF蛋白与D-乳酸在体外共孵育，并通过LC-MS/MS分析，发现YdiF能高效催化D-乳酸辅酶A的生成。遗传学实验进一步证实：过表达YdiF的大肠杆菌菌株K_D-la水平显著升高，而敲除ydiF基因的菌株K_D-la水平则显著降低。这些结果证明YdiF是一种D-乳酸辅酶A转移酶，它将D-乳酸转化为D-乳酸辅酶A，从而用于赖氨酸D-乳酸化反应。

3. 大肠杆菌中赖氨酸D-乳酸化蛋白的鉴定与验证

通过抗K_D-la抗体富集结合nano-HPLC-MS/MS分析，研究人员首次绘制了大肠杆菌的D-乳酸化修饰谱图，共鉴定到71个蛋白上的86个K_D-la位点。为了确保鉴定的准确性，他们合成了与体内修饰序列相同的肽段进行比对，例如GlyA蛋白K331和GapA蛋白K257的修饰肽段，其质谱图与合成肽段几乎完全匹配，从而可靠地证实了K_D-la的存在。

4. 大肠杆菌D-乳酸化组的功能注释分析

对鉴定到的D-乳酸化蛋白进行功能富集分析发现，它们主要参与核酸代谢、ATP代谢、糖酵解和核糖体功能等生物过程。KEGG通路分析显示，这些蛋白显著富集于次级代谢物生物合成、氨基酸生物合成、碳代谢和核糖体等通路。蛋白质互作网络分析进一步揭示，53个D-乳酸化蛋白高度互连，功能上与核糖体、糖酵解和翻译因子活性相关，表明K_D-la可能在能量代谢调控中扮演重要角色。

5. K_D-la响应厌氧应激和能量条件的动态变化

实验证实，在厌氧条件下培养的大肠杆菌，其K_D-la水平显著且广泛地升高。此外，使用不同碳源（乙酸盐、葡萄糖、D-乳酸、麦芽糖、琥珀酸盐）培养细菌时，K_D-la水平也受到显著调节，建立了代谢过程与赖氨酸D-乳酸化之间的联系。研究人员重点关注了负责将丙酮酸转化为D-乳酸的乳酸脱氢酶LdhA，发现过表达ldhA能升高K_D-la水平，而敲除ldhA则降低K_D-la水平及D-乳酸产量，证明LdhA通过调节D-乳酸代谢来影响K_D-la水平。

6. CobB介导大肠杆菌中的去D-乳酸化

已知CobB是大肠杆菌中主要的去酰化酶。本研究发现，敲除cobB的菌株在M9培养基中K_D-la水平轻微升高，而过表达CobB则显著降低K_D-la水平。体外实验进一步证实，将纯化的候选底物蛋白Dps和GapA与CobB共孵育后，其K_D-la水平显著下降，证明CobB在体外和体内均能催化去除赖氨酸D-乳酸化，是一种去D-乳酸化酶。

7. GapA K257_D-la对细菌生长的影响

功能分析表明D-乳酸化蛋白显著富集于糖酵解通路。研究人员聚焦于糖酵解关键酶甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GapA)，其257位赖氨酸(K257)的D-乳酸化经质谱验证。他们将K257突变为谷氨酰胺(GapA^K257Q，模拟永久性乳酸化)，发现该突变体酶活显著降低。过表达GapA^K257Q的菌株，在以葡萄糖或甘油为唯一碳源时，生长均慢于过表达野生型GapA的菌株，且细胞内GapA酶活更低。这表明GapA K257_D-la能影响细菌生长。进一步研究发现，CobB可以在体外去除GapA K257肽段的D-乳酸化修饰，去除修饰后的GapA酶活增强。在体内，野生型菌株比ΔcobB菌株生长更快，且细胞内GapA活性更高。这些结果表明，CobB通过擦除GapA K257_D-la来调控酶活和细菌生长。

结论与讨论

本研究首次在原核生物大肠杆菌中系统揭示了一条完整的、由D-乳酸驱动的赖氨酸D-乳酸化(K_D-la)翻译后修饰通路及其调控机制。该通路的核心在于：糖酵解产生的D-乳酸，在乙酸辅酶A转移酶YdiF的催化下生成活性供体D-乳酸辅酶A，进而修饰特定蛋白质的赖氨酸残基；而去乙酰化酶CobB则负责反向擦除这一修饰，从而构成一个可逆的调控开关。

这项研究的科学意义重大。首先，它突破了以往关于乳酸化修饰主要集中于L-乳酸的认知，发现了手性对映体D-乳酸独特的生物学功能，揭示了原核与真核生物在利用手性代谢物进行调控方面的进化差异。其次，研究鉴定出的首个细菌D-乳酸化修饰图谱，显示修饰蛋白高度集中于中心代谢途径，特别是糖酵解，强烈提示K_D-la是细菌感知和适应能量状态（如缺氧）的重要代谢调节器。最后，通过对GapA蛋白的功能解析，研究直接证明了特定的D-乳酸化修饰能够调控关键代谢酶的活性，进而影响细菌的生理表型（如生长），为理解蛋白质修饰如何精细调控微生物代谢提供了范例。

该工作为后续研究开辟了多个方向：D-乳酸化修饰是否广泛存在于其他细菌乃至古菌中？它如何响应更多环境信号？除了GapA，其他修饰蛋白的功能如何？更重要的是，肠道菌群产生的D-乳酸能否通过类似机制影响宿主细胞功能？这些问题有待深入探索。总而言之，这项研究不仅发现了一种新的蛋白质修饰形式，更将D-乳酸从一个简单的代谢终产物，提升为连接细菌代谢状态与蛋白质功能调控的关键信号分子，为从化学手性和代谢修饰的全新维度理解生命调控的复杂性提供了重要基石。