《Journal of Chromatography A》：A fast and simple method for GC-MS quantification of galanthamine in
Hippeastrum papilio (Ravena) Van Sheepen and assessment of its alkaloid fractions
编辑推荐：
建立基于盐酸水溶液提取和直接GC-MS分析的石蒜碱快速检测方法，验证其灵敏度达2 ng/mL，适用于水仙属新植物源质量控制。
Rumen Denev|Strahil Berkov
保加利亚科学院生物多样性与生态系统研究所化学生态学与天然产物组，G. Bonchev街23号，索菲亚1113，保加利亚
摘要
背景
加兰他敏（Galanthamine）是一种乙酰胆碱酯酶（AChE）抑制剂，用于治疗轻度至中度的阿尔茨海默病症状。它既可以通过化学合成方法获得，也可以从石蒜科（Amaryllidoideae）植物中提取。目前有一些经过验证的GC-MS和HPLC-MS方法可用于测定植物材料中的加兰他敏含量。但这些方法都需要多步骤的样品处理过程，并且会使用有毒溶剂。对于新植物来源（例如Hippeastrum papilio）的样品评估和提取方法开发，需要根据该植物的生物碱成分来验证定量分析方法。
结果
研究了从Hippeastrum papilio原料中提取加兰他敏的最佳方法，发现0.072%的盐酸水溶液是最有效的提取剂。将总提取物（1毫升）的1微升直接注入GC-MS系统，无需使用有毒溶剂进行纯化。测定了该方法的选择性、线性、灵敏度、精确度、准确性和稳定性。在SIM模式下，加兰他敏的最低检测限（LLOQ）和最低定量限（LLOD）分别为10纳克/毫升和2纳克/毫升。该方法被用于评估植物原料、生物碱组分及提取效果。
意义
该方法描述了最快、最简单的加兰他敏提取过程，并实现了直接将水溶液注入GC-MS进行定量分析。与LC-MS相比，使用EIMS检测器能够为新的加兰他敏植物来源提供更多有价值的信息和优势。
引言
加兰他敏（GAL）是三种用于治疗轻度至中度阿尔茨海默病症状的乙酰胆碱酯酶抑制剂之一。阿尔茨海默病是一种慢性、进行性的神经退行性疾病，是60岁以上人群中最常见的痴呆类型。全球有超过5700万人患有痴呆症，其中60-70%由阿尔茨海默病引起。每年新增痴呆病例近1000万例，给全球经济造成1.3万亿美元的损失。
基于乙酰胆碱酯酶抑制剂的阿尔茨海默病治疗基于胆碱能假说，该假说认为该疾病是由于胆碱能神经元活性下降及乙酰胆碱合成减少所致。加兰他敏通过抑制AChE导致乙酰胆碱在突触间隙积累，从而增强烟碱型和毒蕈碱型受体的兴奋作用，延长神经传递的持续时间和强度。与其他获批的AChE抑制剂（如多奈哌齐和利瓦斯蒂明）不同，加兰他敏还能与烟碱型受体相互作用，在乙酰胆碱存在下增强其活性，从而对患者产生益处。
工业上，加兰他敏既可以通过合成方法获得，也可以从石蒜科植物中提取。目前常用的植物原料包括：东欧的Leucojum aestivum（干重中含0.1至5.0毫克/克的GAL）、西欧的Narcissus pseudonarcissus cv. Carlton（干重中含2.2至3.3毫克/克的GAL）以及中国的Lycoris属植物（干重中含0.2至5.0毫克/克的GAL）。
近年来，发现Hippeastrum papilio是一种更好的加兰他敏植物来源，因其含有较高量的GAL且植株较大。这种植物是常绿植物，没有休眠期。初步定量结果显示，其鳞茎中GAL含量可达5.8毫克/克干重，叶片中含量可达5.7毫克/克干重。
为了开发和优化从新植物来源中提取和纯化加兰他敏的工业工艺，必须拥有可靠的定量分析方法，一方面用于测定植物原料和生物碱提取物中的目标化合物含量，另一方面用于监测其他伴随存在的生物碱，以确保质量控制。通常，生物碱的分离和GAL的纯化是通过液-液酸碱（LLAB）提取法与有机溶剂（如氯仿、二氯甲烷和己烷）完成的，但这可能导致提取过程中产生生物碱杂质或降解产物。
加兰他敏的含量可以通过液相色谱（HPLC）、气相色谱（GC-MS和GC-FID）、核磁共振（NMR）、薄层色谱（TLC）和毛细管电泳（CE-UV）等方法测定。然而，由于分析设备成本低廉且易于获取，GC-MS和GC-MS是常用的方法。对于加兰他敏的定量分析，不同检测器具有不同的优缺点。例如，使用非选择性检测器（如UV、DAD、FID）时，需要复杂的样品处理步骤，包括通过固相或液-液提取法分离和浓缩生物碱组分。此外，还需根据植物物种的生物碱组成开发复杂的洗脱程序。在生物碱分离过程中，许多不需要的代谢物会被去除，从而提高GAL的色谱分离效果并减少基质效应。Akram等人总结了加兰他敏提取和分馏的分析方法；Mustafa等人报道了使用LC-UV/DAD的定量方法；Pavia等人开发并验证了一种UPLC-ESI-MS方法用于石蒜科植物中GAL的定量，该方法包括生物碱分馏步骤，最低检测限和最低定量限分别为5纳克/毫升和20纳克/毫升。使用灵敏且选择性的MS检测器可以简化样品处理过程，避免生物碱分馏。Li等人和Liyanage等人使用三步法（包括70%乙醇或90%甲醇提取、提取剂蒸发以及在流动相中重构干总提取物）通过LC-MS/MS测定GAL含量。然而，LC-MS在方法开发方面存在一些限制，如缺乏用于鉴定和监测生物碱组分的标准化合物的质量谱库，这可能导致同分异构体的鉴定困难。
在GC-MS分析中，电子撞击质量检测器能够在标准条件下提供高度可重复的质量谱，从而无需使用标准品即可识别复杂混合物中的目标化合物和其他化合物。大多数方法在GC-MS分析前会先进行生物碱的分离和浓缩。据我们所知，已有三种GC-MS方法被验证用于植物样品中GAL的定量，但其中两种方法未采用生物碱分馏步骤。Gotti等人使用甲醇提取植物材料，提取后用含0.05%醋酸的甲醇重构干提取物再进行GC-MS分析，其检测限为1.8微克/毫升。后来，Berkov等人开发了一种GC-MS方法，将总甲醇提取物中的样品硅化后再进行GC-MS分析，检测限和定量限分别为2微克/毫升和5微克/毫升。
现有的加兰他敏定量方法大多依赖有机溶剂（如甲醇用于制备总提取物、吡啶和BSTFA用于衍生化、卤代溶剂用于生物碱分馏），但这些溶剂具有毒性。相比之下，酸化水是一种环保的提取剂，常用于工业提取。直接将水溶液注入GC-MS可以避免耗时的生物碱分离过程，同时减少样品制备过程中的降解产物和杂质生成。这种方法在基于水提取的工业生产中具有优势。
本研究的目的是开发一种快速、简单、可靠且环保的加兰他敏定量方法，适用于Hippeastrum papilio的鳞茎和叶片样本，以便监测其中伴随存在的生物碱组分。这种方法将有助于开发基于水的（环保型）工业提取工艺，符合绿色化学原则。
溶剂和试剂
加兰他敏氢溴酸盐溶液（10毫克/毫升）由Sofarma AG（保加利亚）提供。甲醇（HPLC级）、氯仿、盐酸和氨（分析级，Alfa Aesar）购自Valerus（网址：https://valerus-bg.com）。碳氢化合物混合物（C9-C36，Restek，产品编号31614）和N,O-双（三甲基硅基）三氟乙酰胺（BSTFA，Sigma–Aldrich，产品编号15222）购自FOT（网址：www.fot.bg）。
植物材料
本研究使用了多公斤的干燥鳞茎作为植物原料。
结果与讨论
本研究提出了一种新的GC-MS定量方法，用于测定植物材料中的加兰他敏含量，该方法采用酸化水提取，无需纯化步骤或有机溶剂，且直接将水溶液注入GC-MS系统。样品在硅化处理后进行生物碱组分分析。
此外，还研究了酸性条件下加兰他敏的降解产物和提取杂质形成情况。
结论
本研究开发的GC-MS方法用于测定Hippeastrum papilio植物原料中的加兰他敏含量，该方法简单、快速、可靠且稳定性好，可轻松应用于不同植物物种中加兰他敏含量的快速筛查。样品处理过程是文献中报道的最简单方法之一，包括直接将水提取物注入GC-MS系统。该方法的灵敏度、选择性和准确性与报道的LC-MS方法相当。
作者贡献声明
Rumen Denev：概念构思、方法设计、实验实施、数据可视化、软件开发、数据整理及初稿撰写。
Strahil Berkov：概念构思、方法设计、实验监督、资源获取、项目管理、初稿撰写及审稿编辑。
数据可用性声明
数据可应要求提供。
未引用参考文献
[26,28]
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本研究结果的财务或个人利益冲突。
致谢
本研究得到了NextGenerationEU（合同编号67 /BG-RRP-2.017-0021-C01，保加利亚共和国恢复与韧性计划）的资助。作者感谢Berbee Beheer B.V.（荷兰）提供Hippeastrum papilio的原材料。
