《Journal of Hazardous Materials》：Adaptive laboratory evolution enables microbial access to untreated, virgin high-density polyethylene under environmentally relevant conditions
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本研究通过适应性实验室进化技术，从活性污泥和垃圾填埋场样本中分离出Pandoraea sp. B8菌株，证实其在未处理高密度聚乙烯（HDPE）表面定植并引发可重复的表面劣化及持续生物碳矿化（CO?生成）。该发现表明，通过长期定向选择压力，微生物能够逐步适应并降解未预处理的HDPE，为解决HDPE环境持久性提供新策略。
朴Gyulim|金Yedam|李Young Seok|金Youngsuk|李O–Mi|李Kwang Min|徐Sungbaek|黄Dae-Youn|孙Hong–Joo
韩国釜山国立大学生命科学与环境生物化学系/生命与产业融合研究所，Miryang 50463
摘要
合成塑料，尤其是聚乙烯，由于其化学惰性和对自然降解的抵抗力，成为持久性的环境污染物。其中，高密度聚乙烯（HDPE）构成了一个关键挑战，因为其高度结晶和疏水性的结构严重限制了微生物的定殖和碳的利用。大多数关于HDPE生物降解的研究都依赖于经过物理化学预处理的材料，而未经处理的原始HDPE的微生物矿化过程尚未得到充分探索。在这项研究中，采用了适应性实验室进化（ALE）方法来分离能够在环境相关选择压力下降解未经处理的HDPE的微生物。作为接种源使用了活性污泥和城市垃圾填埋场样本，这些环境中塑料与多种微生物群落长期共存。长期ALE实验在含有原始HDPE作为唯一碳源的矿物盐培养基中进行，施加了严格的方向性选择压力。通过这种方法，分离出了Pandoraea sp. B8菌株，该菌株能够使HDPE薄膜发生可重复的表面劣化并持续生长。重要的是，HDPE的降解伴随着可测量的二氧化碳释放，表明这是生物矿化过程，而不仅仅是表面改性。总体而言，这些结果表明，进化适应可以使微生物在无需物理化学预处理的情况下利用未经处理的HDPE，并影响这种聚合物在环境条件下的持久性和转化。
引言
由于低成本、耐用性和多功能性，合成塑料已成为现代社会不可或缺的材料，广泛应用于包装、建筑、医疗设备和消费品领域。然而，这些特性也导致了前所未有的塑料废物积累。近几十年来，全球塑料产量呈指数级增长，每年产生的塑料废物超过3.5亿吨；同时，仅有不到10%的塑料得到有效回收，从而导致长期的环境问题[1]、[2]、[3]。这种效用与持久性之间的不平衡使塑料成为现代最严重的人为污染物之一。
随着塑料通过物理、化学和生物过程分解，产生了微塑料，这些微塑料现在普遍存在于水生、陆地和大气环境中。微塑料可以被各个营养级的生物摄入，并可能作为有毒添加剂和吸附污染物的载体，引发生态破坏和潜在的人类健康影响[4]、[5]。污水处理厂和城市垃圾填埋场是塑料碎片和微塑料的主要聚集地，在这里塑料颗粒与密集多样的微生物群落共存，随后通过废水、污泥或渗滤液重新分布[6]、[7]。因此，这些系统成为了塑料衍生污染物和微生物群落长期相互作用的场所。
传统的塑料废物管理策略，包括焚烧、填埋和机械回收，仍然受到高能耗、二次污染或材料降级等限制[2]。物理化学和高级氧化方法可以加速聚合物的氧化，但通常需要大量的能量或化学投入，且往往只能生成部分氧化的残留物，无法完全消除聚合物中的碳[8]。相比之下，微生物过程在温和条件下具有将塑料衍生碳转化为生物质和二氧化碳（CO2）的潜力，从而将塑料不仅仅视为固体废物，而是视为可以通过生物途径矿化的持久性环境污染物[9]、[10]。
在合成聚合物中，聚乙烯（PE）是最具环境持久性的挑战之一。由于其化学惰性的碳-碳（C–C）主链和强疏水性，其生物降解特别困难；对于高密度聚乙烯（HDPE）而言，其高度结晶和有序的分子结构进一步限制了微生物的定殖和碳的利用[9]、[11]。与低密度聚乙烯（LDPE）相比，HDPE由于结晶度更高、链分支较少以及聚合物链移动性受限，对微生物生物降解的抵抗力更强[9]、[11]、[12]。尽管有关微生物与PE相互作用的报道很多，但大多数文献中记录的生物降解现象仅限于LDPE，或者表现为表面侵蚀而缺乏持续的微生物生长[13]、[14]、[15]、[16]、[17]。最近的研究一致表明，原始或接近原始状态的HDPE的有效生物降解仍然非常有限。大多数报道的方法依赖于紫外线照射、热氧化、等离子体改性或在微生物接触前引入表面官能团的促氧化剂[8]、[10]、[11]、[18]。即使在这些优化条件下，矿化效率也通常较低，且在不同实验室之间缺乏重复性。此外，最近的批判性综述强调，仅凭质量损失、表面粗糙化或碎片释放等指标不能作为生物降解的确切证据，需要通过光谱学、热分析、形态学和呼吸计量学等多重标准进行严格验证才能证实聚合物中碳的生物转化[10]、[19]、[20]。重要的是，大多数报道HDPE生物降解的研究都依赖于预处理材料，如紫外线（UV）照射、化学氧化或等离子体改性，这些处理会引入官能团和表面缺陷，从而从根本上改变聚合物的反应性[10]、[11]、[18]、[21]、[22]、[23]、[24]、[25]。这样的预处理大大降低了微生物攻击的难度，可能会掩盖原始聚合物的固有生物降解性。因此，在温和且环境可行的条件下，未经处理的原始HDPE能够实现可重复的微生物生长和碳矿化的明确证据仍然非常稀缺。
这一差距不仅反映了实验努力的不足，还反映了根本的生物学限制。未经处理的HDPE是一种极端难处理的底物，缺乏可利用的官能团，表面润湿性不足以支持常规实验时间尺度下的微生物增殖[9]、[10]、[11]、[19]。其高结晶度和有限的链移动性进一步限制了酶的渗透和代谢产物的扩散，从而严重限制了初始氧化反应的能量回报[9]、[10]、[11]。在这种条件下，短期筛选或传统的富集方法本质上不利于检测稀有但可能具有适应性的表型[26]、[27]、[30]。从这个角度来看，原始HDPE的生物降解是一个进化挑战，需要长期的方向性选择压力来放大微小的适应性优势并固定适应性特征。适应性实验室进化（ALE）提供了一个框架，通过长期选择使微生物逐渐适应非天然的、高度难处理的底物[26]。与主要选择现有代谢特征的常规富集策略不同，ALE促进了在持续底物限制下的调节网络、生理网络和代谢网络的逐步优化。ALE不仅仅是一个快速筛选工具，而是在长时间培养过程中促进了表面相互作用、聚合物改性和下游代谢的逐步改进[27]、[28]、[29]、[30]。对于像HDPE这样高度结晶和疏水的聚合物，这种长期选择特别适合通过逐步增强表面定殖和氧化活性来克服结构障碍。尽管ALE在压力适应和代谢工程中得到了广泛应用，但它作为使微生物能够利用未经处理的合成聚合物的策略却很少被系统地探索。因此，聚合物结构限制与长期微生物适应之间的关系仍然不够明确。
在这项研究中，我们应用长期ALE方法处理了暴露于塑料的环境微生物群，以验证进化适应是否可以使微生物利用未经处理的原始HDPE。选择活性污泥和城市垃圾填埋场环境作为接种源，因为这些环境长期暴露于塑料衍生污染物，并具有复杂的微生物组合。通过在含有原始HDPE作为唯一碳源的矿物培养基中施加持续的选择压力，我们筛选出了能够在聚合物表面持续生长的微生物。这一策略导致分离出一种细菌菌株，该菌株能够可重复地诱导HDPE表面劣化，并支持有意义的二氧化碳释放，这与聚合物中碳的矿化过程一致。与大多数依赖于预处理聚合物或间接劣化指标的先前研究不同，本研究通过协调的表面分析、化学分析、热分析、酶分析和呼吸计量学分析提供了生物介导的未经处理HDPE转化的综合性证据。总体而言，这项工作表明，原始HDPE的表面抗性并非绝对的生物学限制，而是一个进化上的限制，并为通过微生物矿化处理HDPE这一持久性污染物提供了基于机制的框架。本研究的整体实验流程，包括适应性实验室进化、菌株分离、生物降解检测、酶分析和呼吸计量学矿化测量，在图1中进行了示意图说明。
部分内容摘录
化学物质和材料
本研究中使用的HDPE底物包括：(i) 由Sunjong Lee博士（韩国工业技术院）提供的不规则HDPE微塑料（密度为0.94–0.97 g/cm3）；(ii) 商用HDPE薄膜（厚度约为10 μm，Cleanlab有限公司，韩国）。通过共聚焦激光扫描显微镜和扫描电子显微镜（SEM）成像确认，这些微塑料的粒径主要在30–40 μm范围内（见图S1）。所有HDPE材料均经过消毒处理。
ALE后HDPE生长菌株的分离和筛选
在添加了HDPE的MS培养基中进行了一年的ALE实验，共分离出37株能够在HDPE薄膜覆盖的琼脂平板或含有HDPE微塑料的平板上生长的菌株。图2A和B展示了在HDPE薄膜下定殖或在HDPE微塑料上可见生长的菌落示例。从这些菌株中，有8株在营养琼脂上纯化并进一步筛选。其中5株来源于活性污泥
结论
本研究证明，在环境相关条件下，通过长期ALE可以实现对未经处理的原始HDPE的微生物利用。通过在含有HDPE作为唯一碳源的培养基中施加持续的选择压力，我们分离出了一种名为Pandoraea sp. B8的菌株，该菌株能够在HDPE表面定殖并使其劣化；这一过程伴随着可测量的二氧化碳释放，从而支持了聚合物中碳的矿化。这些结果表明，HDPE的持久性并非绝对的生物学限制，而是一个进化上的限制。
环境影响
高密度聚乙烯（HDPE）是一种持久性的环境污染物和危险物质，由于其化学惰性和对自然降解的抵抗力，会在水生和陆地生态系统中积累。研究表明，在环境可行的选择压力下，长期适应性实验室进化可以使微生物利用未经处理的原始HDPE，而无需物理化学预处理或共底物。
CRediT作者贡献声明
黄Dae-Youn：写作 – 审稿与编辑。徐Sungbaek：写作 – 审稿与编辑。李Kwang Min：写作 – 审稿与编辑。李O–Mi：可视化。孙Hong-Joo：写作 – 初稿撰写，监督，概念构思。金Youngsuk：验证，形式分析。李Young Seok：方法学，研究。金Yedam：方法学，研究。朴Gyulim：方法学，研究。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
