三氯卡班和双酚S对斑马鱼的联合毒性：多层次协同效应及其作用机制

《Journal of Hazardous Materials》：Combined Toxicity of Triclocarban and Bisphenol S in Zebrafish: Multi-Level Synergistic Effects and Driving Mechanisms

协同毒性机制及模型修正研究：以TCC和BPS为例，通过斑马鱼多水平毒性分析发现混合物显著增强氧化应激和凋亡，引发心血管、免疫及神经系统的多系统损伤，验证组合指数（CI）模型较传统浓度加和模型（CA）更适用于混合物风险评估。

　　

王泽军|沈菊|杨晓|苏新聪|韩晓文|孟凌浩|戴卓娅|丁婷婷|钱秋慧|刘淑慎|王学东|王慧莉

中国苏州科技大学环境科学与工程学院市政污水资源化利用技术国家与地方联合工程实验室，苏州215009

摘要

毒理学研究的进展明确了化学物质在生物不同层面的毒性作用；然而，驱动化学混合物毒性的机制仍不明确。此外，混合物风险评估中常用的浓度叠加（CA）模型可能因忽略化学相互作用而引入预测偏差，但这种偏差的影响尚未得到充分理解。以斑马鱼为模式生物，我们系统评估了三氯卡班（TCC）和双酚S（BPS）的混合物。结果表明，根据CA模型预测的浓度制备的混合物在多个生物层面上表现出协同毒性。转录组学分析显示，TCC和BPS之间的相似性有限，主要在功能属性上存在差异，而非差异表达的基因数量不同。混合物暴露增强了转录反应并引入了新的生物过程，揭示了驱动协同性的分子机制。值得注意的是，代谢、MAPK、钙、Apelin和FoxO通路显著富集，共同促进了氧化应激和细胞凋亡。这些过程通过相互连接的通路进一步协同介导多系统毒性，表现为心血管异常（心率升高、心包水肿、尾静脉收缩）、免疫失调（先天免疫细胞增殖伴细胞因子改变）和神经毒性（神经元发育受损、多巴胺耗竭和GABA水平升高）。这些协同效应还导致 swim bladder 和 yolk sac 等器官畸形，扰乱了正常的生理活动，最终影响胚胎发育，导致死亡率增加。相比之下，使用组合指数（CI）作为校正因子后，联合效应主要表现为加性或拮抗性。总体而言，本研究为TCC-BPS相互作用提供了机制上的见解。基于叠加模型的预测可能忽略化学相互作用，导致毒理学偏差，而CI则能在生物不同层面提供有效的校正，突显了其在混合物风险评估中的实用性。

引言

三氯卡班（TCC）广泛用于个人护理产品中以抑制细菌生长[1]，[2]。同样，双酚S（BPS）在塑料产品（如食品包装和电子产品）中也有广泛应用，以保持材料稳定性[3]，[4]。含有TCC和BPS的废物进入土壤和水中，由于它们难以降解，这两种物质会在环境中长期存在[5]，[6]，[7]。在环境介质中检测到的这两种物质的浓度可高达mg/L[8]。它们经常共存于水生和沉积环境中，例如东海和珠江[5]，[9]。在动物和人类（如宠物、人类尿液）中也检测到了它们的存在[5]，[7]，[10]，[11]。TCC在斑马鱼中表现出内分泌[12]、肠毒素[13]、生殖[14]、致癌[15]、氧化应激[16]和神经毒性[17]作用，而BPS会破坏内分泌功能，引发发育和行为障碍[18]，[19]，[20]，并引发炎症，可能具有心血管毒性[21]。这些发现表明，这两种物质对多器官和多层面健康构成风险。

与单独暴露相比，实际环境中的混合暴露对污染物的暴露状态更为敏感[22]。尽管大多数污染物都尽量控制在无效应浓度以下，但数十甚至数百种污染物的共存可能会由于相互作用和协同效应产生不可忽视的影响。在这种情况下，相应的混合浓度也可能达到mg/L水平[23]，[24]。在这种情况下，仅基于环境浓度对单一化学物质进行毒性测试无疑会低估风险，这对环境来说是一种过于保守的策略[23]，[25]。目前，研究人员意识到，即使对单一化学物质进行风险管理，它们形成的混合物也会带来不可忽视的风险；因此，越来越多的研究呼吁对混合物进行测试和监测[26]，[27]。已经出现了一些相关技术，例如非靶向分析技术可以检测未知化学物质以全面了解样品组成[28]，频繁项集挖掘技术用于识别和提取混合物的成分，以及高通量毒性测试技术[29]，[30]。这些技术的发展为混合物状态和实际环境中的化学污染物风险评估奠定了重要基础。

在当前的混合物评估框架中，经常使用加性参考模型（如浓度叠加（CA）和独立作用（IA）来评估联合效应。通常认为CA适用于作用机制（MOAs）相似的化学物质，而IA适用于作用机制不同的化学物质。然而，这些模型更多被视为数学工具，而非真正的机制表征[31]。在适用性方面，CA依赖于等效数据，而IA基于效应，因此更适合进行相互作用分析。尽管存在这些差异，大多数评估指标（如混合物风险指数（RI）仍然源自CA。重要的是，从CA和IA获得的结果通常是不可互换的。因此，基于CA的评估在风险特征描述中起着特别重要的作用。然而，广泛依赖基于CA的模型隐含了在关键暴露阈值下的加性假设，同时对于这些浓度下毒性相互作用的实际产生方式了解有限。除了模型选择之外，确定阈值浓度在风险评估中也至关重要。无观察效应浓度（NOEC）和亚致死剂量（如LC₁₀、LC₅₀）被广泛用作参考点[32]。例如，无论是使用评估因子方法还是物种敏感性分布（SSD）方法[33]，[34]，预测的无效应浓度（PNECs）通常都是从NOEC和亚致死剂量数据中得出的。随着毒理学方法的进步，现在可以获得越来越多关于个体、组织、器官和调控机制的信息[35]。一个关键未解决的问题是，这些生物层面上的毒性相互作用在阈值剂量下如何表现，以及协同或拮抗机制在其中是如何差异驱动的。解决这一问题对于推进混合物毒理学和细化生态风险评估至关重要。

在本研究中，选择了两种广泛关注的污染物TCC和BPS作为实验对象。使用斑马鱼作为模式生物来分析联合暴露下的毒理学相互作用和潜在机制。首先，采用组合指数（CI）来评估急性毒性测试后TCC和BPS在不同浓度比下的联合效应。进一步使用加性参考模型预测的浓度和组合指数（CI）校正后的浓度来评估TCC和BPS的联合效应。这些效应在四个生物层面上进行了评估：个体（表型和行为）、系统（心血管、免疫和神经）、调控机制（氧化应激和细胞凋亡）以及组学方法（转录组学）。最后，将毒理学评估结果与支持性文献证据相结合，构建了TCC和BPS联合暴露下的毒性调控机制图，以阐明它们的相互作用模式，并为混合物风险评估提供科学依据。

部分摘录

化学物质和测试生物

TCC（CAS编号101-20-2，纯度99.5%）和BPS（CAS编号80-09-1，纯度99.5%）均从Sigma Aldrich（美国圣路易斯）购买。它们的标准品溶解在来自浙江中兴试剂公司（中国杭州）的99.9%丙酮中。

本研究使用了四种斑马鱼品系：野生型AB系和三种转基因系，Tg(elavl3: EGFP)、Tg(coro1a: EGFP)和Tg(kdrl: mCherry）。品系选择的理由及相应实验应用的详细信息如下

TCC、BPS及其混合物的急性致死性

在急性毒性测试中，通常使用拟合的DRC和基于死亡率的LC₅₀来评估化学物质的生物毒性。TCC的LC₁₀- LC₉₀范围为100 -1000 ug/L，而BPS的LC₁₀- LC₉₀范围为10-100 mg/L（图1-A，B），表明TCC对斑马鱼的毒性是BPS的100倍。这与它们的LC₅₀（570.9 μg/L vs 62,524.7 μg/L）和LC₁₀（150.5 μg/L vs 16,905.4 μg/L）一致。如图1C-F和表S4所示，三种混合物的DRC分布在

混合物风险评估中的应用和意义

在混合物风险评估中，通常使用从NOEC或LC₁₀得出的PNEC和mPNEC值作为参考阈值。收集并整理了TCC和BPS的15个和11个毒性指标的NOEC值（表S8-9）。在构建的多个SSD模型中（表S10），TCC的最佳SSD模型基于Weibull函数（R2=0.98）通过参数比较确定（图7A），而BPS的模型基于Dagum函数

结论

本研究全面评估了TCC和BPS在斑马鱼中的联合毒性，涵盖了多个生物层面，包括转录组学、调控机制、系统和个体。得出了两个关键结论：（i）TCC-BPS混合物引起的协同和拮抗效应在不同生物层面上表现出显著的一致性；（ii）虽然CA预测的混合物浓度一致表现出协同效应，但应用CI后

环境影响

三氯卡班（TCC）和双酚S（BPS）——这两种常见的个人护理和塑料产品污染物——经常在水生环境中共同存在。研究表明，即使在低浓度下，它们的混合物也会在斑马鱼中引起协同毒性，通过涉及氧化应激和细胞凋亡的相互连接的通路。这种相互作用加剧了心血管、免疫和神经系统的不良影响，导致发育畸形和死亡率增加。

伦理批准

本研究获得了中国苏州科技大学伦理委员会的批准。

CRediT作者贡献声明

丁婷婷：方法学、数据管理。戴卓娅：方法学、正式分析、数据管理。孟凌浩：方法学、正式分析、数据管理。韩晓文：正式分析、数据管理。王学东：可视化、监督、研究。王泽军：撰写——审稿与编辑、方法学、概念化。刘淑慎：方法学。钱秋慧：项目管理、数据管理。金燕：可视化、监督、研究。苏新聪：可视化

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（22306141, 32371705, 22305167）、江苏省自然科学基金（BK20231341）和苏州市科技项目（SS202150）的共同支持。