《Advanced Science》：Integrated Single-Cell and Spatial Transcriptomics Reveal Cell-Type-Specific Immune Regulatory Networks in Maize Responding to Southern Corn Rust
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本研究为应对南方玉米锈病(SCR)对全球玉米生产的严重威胁，利用单核RNA测序(snRNA-seq)和空间转录组测序(stRNA-seq)技术，解析了玉米叶片在Puccinia polysora早期侵染过程中的细胞类型特异性转录动态。研究揭示了叶肉细胞和表皮细胞是24 hpi关键防御反应的起始位点，并观察到RLPs/RLKs和茉莉酸途径的特异性激活。通过多组学分析和VIGS功能验证，鉴定出关键感病因子ZmXET1和抗性组分ZmRBG。这项工作绘制了高分辨率的玉米抗锈时空图谱，为抗病育种提供了新的靶点。
玉米是全球至关重要的粮食、饲料和工业原料作物，然而，由Puccinia polysora引起的南方玉米锈病是其生产的主要威胁，可导致30%-50%甚至更高的产量损失，严重威胁全球粮食安全。尽管已克隆出一些抗病基因如RppK，但玉米对抗P. polysora的细胞类型特异性防御机制及其复杂的调控网络仍不清楚，这阻碍了有效病害管理策略的发展。
为了在细胞和空间分辨率上解析玉米叶片的早期防御动态，研究人员整合了单核RNA测序和空间转录组测序这两种前沿技术。他们选取抗性自交系Qi319，在其幼苗V3期接种P. polysora，并在接种后24小时和48小时这两个关键的早期侵染时间点，采集叶片样本进行snRNA-seq和stRNA-seq分析。此外，研究还采用了组织学分析（如WGA荧光染色）、加权基因共表达网络分析、拟时序分析、细胞间通讯分析以及病毒诱导的基因沉默等功能验证实验。
2.1 The Infection Establishment of P. polysorain Maize Seedling Leaves
通过表型和WGA-AF488荧光染色组织学分析，研究人员确认了P. polysora在玉米叶片中的早期侵染进程。虽然24、48、72 hpi均未见明显症状，但WGA染色显示，真菌在24 hpi已成功侵入，形成气孔下囊等结构；到48 hpi，菌丝分支和定殖增加，并形成吸器；72 hpi菌丝生长进一步扩展。定量分析证实真菌生物量从48 hpi到72 hpi逐步增加。基于此，研究选择24 hpi和48 hpi作为关键早期时间点进行后续转录组分析。
2.2 Establishment of Cell Types in P. polysora-infected Maize Leaves
通过对snRNA-seq数据的分析，研究从131,601个高质量单细胞中鉴定出8个主要的细胞类型：叶肉细胞、表皮细胞、维管束鞘细胞、伴胞、薄壁细胞、维管组织细胞、保卫细胞和铺路细胞。GO富集分析显示，叶肉细胞中的差异表达基因主要参与氧脂素生物合成和光合作用等过程。通过已发表的标记基因数据库和RNA原位杂交，验证了这些细胞类型及其特异性标记基因。
2.3 Visualization of P. polysoraInfection in Maize Leaves via the Spatial Transcriptomic Atlas
stRNA-seq分析产生了21,388个位点，可清晰解析玉米叶片横截面中的各种亚细胞结构。通过整合空间坐标和已建立的标记基因，将7个聚类注释为5种主要叶片细胞类型：表皮、叶肉、维管束鞘、维管组织和伴胞。分析发现，在P. polysora处理后24和48小时，表皮和叶肉细胞中细胞类型特异性基因的表达显著增加，表明这两种细胞在应对侵染中扮演重要角色。
2.4 Cell Type-specific Differential Expression of Immune-related Genes
研究发现，与模式触发免疫相关的受体样蛋白和受体样激酶基因的表达在接种后24小时表现出细胞类型特异性模式，主要在叶肉和表皮细胞中。而大多数NBS-LRR类抗病基因在感染后下调。对茉莉酸和水杨酸信号通路相关基因的分析表明，两者均在24 hpi被主要激活，但未显示出突出的细胞类型特异性反应。
2.5 Co-expression Network Analysis Reveals Core Functional Modules Linked to P. polysoraInfection in Maize Leaves
通过加权基因共表达网络分析，鉴定出14个不同的模块。其中，与维管束鞘细胞强相关的绿松石模块在24 hpi上调，其基因主要参与氧化应激反应；与叶肉细胞相关的绿黄模块在24 hpi被激活，功能与光合作用相关；而与表皮细胞相关的绿色模块在24 hpi显著下调，功能涉及细胞壁生物合成。网络拓扑分析鉴定了各模块的核心基因。
2.6 Differentiation Trajectories and Annotation Reveal the Importance of Defense Cells
对叶肉细胞进行拟时序分析，将其分为光合作用叶肉细胞、叶肉前体细胞、叶肉传递细胞、海绵组织叶肉细胞和防御响应叶肉细胞等功能亚型。轨迹显示，在P. polysora感染下，细胞轨迹在24 hpi发生显著分歧，防御响应叶肉细胞的比例大幅增加。该亚型的差异表达基因主要参与应激反应和活性氧物种响应。
2.7 Cell-cell Communication Reveals the Infection Process from Epidermal Cells to Mesophyll Cells
基于PlantPhoneDB数据库的细胞间通讯分析揭示了表皮细胞、叶肉细胞和维管束鞘细胞之间显著的遗传相互作用。例如，表皮细胞基因ZmHSP90与叶肉细胞基因ZmWAK2在P. polysora感染期间存在相互作用。这些发现强调了细胞通讯在玉米防御中的关键作用。
2.8 Identification of Key Genes Involved in Maize Defense against P. polysora
通过整合snRNA-seq和stRNA-seq数据，研究在24 hpi和48 hpi的时间点，于叶肉和表皮细胞中鉴定出5个核心差异表达基因。其中，ZmXET1在感染后下调，而ZmRBG、ZmEUL、ZmLOX4和Zm00001eb165310上调。通过病毒诱导的基因沉默进行功能验证，发现沉默ZmXET1可显著降低病害严重程度和病原菌生物量，而沉默ZmRBG则增加感病性，表明ZmXET1是关键的感病因子，而ZmRBG是抗性组分。
本研究成功构建了首个整合单核与空间转录组的玉米抗P. polysora时空图谱，立体揭示了抗性玉米基因型早期的免疫景观。研究发现，玉米采用了不同细胞类型间的“分工协作”策略来建立有效防御。虽然表皮和叶肉细胞显示出减弱的早期免疫信号，但内部组织层，特别是维管束鞘和维管薄壁细胞，表现出强烈的防御激活程序，包括活性氧爆发放大和植物激素信号传导。这种空间区室化策略表明，内部细胞充当了第二道防线。
尽管存在真菌转录本代表性低、空间转录组分辨率不足以完全区分相邻细胞类型等技术局限，但这项多组学图谱为理解玉米的空间免疫提供了基础资源。研究不仅鉴定出关键的抗性基因集，还揭示了这些基因在防御中的作用机制。研究结果表明，针对特定细胞反应的精准育种或合成生物学策略，可能提供更有效和稳定的抗性。最终，这项发表于《Advanced Science》的研究，为通过空间优化的免疫设计作物提供了新的思路和潜在靶点。
