《Advanced Science》：Calcium Shock Enables Efficient and Programmable Particle Delivery for Genome Editing Applications
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经典细胞内递送方法如转染和转导，在汇合细胞和类器官中效率低下，且缺乏细胞类型特异性。本研究开发的钙离子休克（CaSh）方法，通过暂时降低胞外钙水平溶解细胞间连接并促进内吞，显著提升了单细胞、集落和类器官中对质粒、核糖核蛋白（RNP）及腺相关病毒（AAV）载体等多种递送颗粒的摄取效率。进一步发展的可编程钙休克（CaSh-Pro）方法，结合分子靶向剂和两亲性肽，实现了在异质细胞群体中对特定细胞类型的偏好性编辑。该研究为复杂系统中的基因组编辑提供了一种简单、通用的方案，有望推动生物学发现和疗法开发。
在生物学研究与疾病治疗领域，将大分子“货物”——如编辑基因的“剪刀”CRISPR-Cas9系统——高效、精准地送入目标细胞内部，始终是一个核心挑战。传统的递送方法，如转染和转导，在单层细胞培养中尚可一用，但面对更为复杂、更能模拟人体真实环境的“三维”细胞结构，如类器官时，就显得力不从心了。效率低下是其一，更棘手的是缺乏“精确制导”能力，无法在由多种细胞类型组成的“微型器官”中，将药物或工具只送到我们想编辑的那一类细胞里。这就好比想修理一栋大楼里某个特定房间的水管，却不得不把整栋楼的门窗都砸开，不仅效果差，还可能造成不必要的破坏。为了突破细胞内递送，尤其是在复杂三维组织结构中实现高效、可编程递送的瓶颈，一项新的研究应运而生。
这项研究发表在国际知名期刊《Advanced Science》上。为了攻克上述难题，研究人员巧妙地从细胞连接的基本原理入手，开发了一种名为“钙离子休克”的创新方法。该方法的核心在于暂时降低细胞外的钙离子浓度。钙离子是维持细胞间紧密连接（如紧密连接）的“水泥”，暂时移除这层“水泥”，可以松动细胞间的“砖墙”，为外来的大分子颗粒打开通道。同时，这一过程还能促进细胞的“内吞”作用，即细胞主动将外部物质“吞”进肚里的过程，从而双管齐下，大幅提升递送效率。更进一步，研究者将这一通用策略与靶向分子结合，发展出了“可编程钙休克”技术，实现了在异质细胞群体中对特定细胞类型的精准递送与编辑。研究表明，这种方法能够显著提高在人诱导多能干细胞、细胞集落以及多种人类类器官（如肾、心、肺、肝、脑、视网膜类器官）中进行质粒转染、CRISPR-Cas9核糖核蛋白编辑以及腺相关病毒转导的效率，且毒性低，不影响细胞正常功能。这为在复杂生物系统中进行高效的基因组编辑和基因治疗研究开辟了新的道路。
研究人员主要运用了以下几项关键技术：首先，建立了“钙离子休克”和“可编程钙休克”的标准实验流程，涉及钙离子浓度切换、离心（旋染）等步骤。其次，利用了多种报告系统进行评估，包括“荧光开启”和“荧光关闭”的基因编辑报告人诱导多能干细胞系。第三，在多种人类类器官模型（肾、心肌细胞、肺、肝、脑、视网膜）中验证方法的普适性。第四，使用了分子靶向技术与蛋白质工程，构建了融合蛋白G的Cas9蛋白，用于实现细胞类型特异性靶向。第五，采用了包括免疫荧光、下一代测序、牛津纳米孔测序、腺相关病毒转导在内的多种分析技术来量化递送和编辑效率。研究所用人诱导多能干细胞系均获得知情同意并在相关伦理委员会监督下使用。
研究结果：
2.1 钙离子休克提高iPS细胞的转染和基因组编辑效率
研究人员开发了钙离子休克方法，通过在颗粒递送步骤暂时降低胞外钙水平，结合短暂离心，随后恢复钙浓度。在分散的人诱导多能干细胞中，该方法将质粒编码的GFP（绿色荧光蛋白）转染效率从约2.1%大幅提升至52.3%。在基因组编辑方面，使用靶向Lox-Stop-Lox序列的CRISPR-Cas9核糖核蛋白进行编辑时，钙休克将编辑效率提高了4倍，达到12.3%。机制研究表明，钙剥夺诱导了紧密连接蛋白ZO1-GFP、JAM-A和occludin从细胞膜向核内体区室的内化，并且增加了荧光右旋糖酐的内吞摄取，证实了该方法通过促进内吞和溶解细胞连接来提升递送效率。
2.2 钙离子休克提高多细胞集落和类器官中的基因组编辑效率
在更接近体内复杂结构的多细胞iPS细胞集落和肾类器官中，紧密连接构成了递送屏障。钙休克同样显著提高了在这些完整结构中的编辑效率。在GFP+的iPS细胞集落中，使用两亲性肽ppTG21+结合钙休克，实现了高达45%的GFP敲除效率。在GFP+肾类器官中，钙休克将CRISPRMAX或肽ppTG21+介导的近端小管细胞GFP敲除效率从0-2%提升至10-15%，并通过下一代测序证实了约16%的插入缺失形成率。与电穿孔相比，钙休克能有效实现编辑，而电穿孔则未能检测到。
2.3 CaSh-Pro实现类器官中特定细胞类型的可编程递送
为了使递送具有细胞类型特异性，研究人员开发了可编程钙休克。他们构建了融合蛋白G的Cas9蛋白，该融合域可非共价结合IgG抗体。通过筛选，他们确定了靶向肾小管上皮细胞（使用抗E-钙粘蛋白抗体，TubuleTracker）和靶向足细胞（使用抗Podocalyxin抗体，PodoTracker）的分子靶向剂。在钙休克条件下，将Cas9-蛋白G核糖核蛋白与这些靶向抗体及内吞体裂解肽E5TAT一同递送至“荧光开启”报告肾类器官，结果显著增强了在目标细胞类型（足细胞或肾小管）中的编辑效率，证明了该方法能在异质细胞群体中实现对特定细胞类型的程序化递送。
2.4 钙离子休克实现多种人类类器官谱系中的“荧光开启”基因组编辑
为了验证钙休克的普适性，研究人员将“荧光开启”报告iPS细胞分化为肾、心肌细胞、肺、肝、眼和脑类器官等多种谱系。钙休克介导的基因组编辑在所有测试谱系的代表性细胞类型中均成功诱导了tdTomato（红色荧光蛋白）的局灶性表达，编辑效率在近端小管和肺类器官中约为7%，在心肌细胞中为11%，在肝细胞中为16%。安全性评估表明，钙休克编辑未引起可检测的基因毒性、细胞凋亡增加、免疫功能激活，且编辑后的肾类器官和心肌细胞簇分别保留了小管右旋糖酐积累和自发搏动等关键生理功能。
2.5 钙离子休克提高AAV对类器官的转导
腺相关病毒是常用的基因治疗载体，但在体外特别是类器官中转导效率低。钙休克极大地增强了AAV8和AAV9血清型在肾类器官近端小管上皮细胞中的转导。例如，AAV8的转导效率从约3.1%提升至14.3%，AAV9在近端小管中的效率从约8%提升至18.4%。在肺类器官中也观察到了类似的转导增强趋势。这表明钙休克能有效提升AAV载体在三维组织模型中的递送效率。
结论与讨论：
本研究开发了一种简单、通用的钙离子休克方法，通过暂时溶解细胞间连接和促进内吞，显著提高了包括质粒、CRISPR-Cas9核糖核蛋白和腺相关病毒载体在内的多种大颗粒向细胞和类器官内的递送效率。其进阶版本CaSh-Pro通过整合分子靶向剂，首次在复杂的异质类器官中实现了对特定细胞类型的可编程、精准递送与编辑。
该方法的意义重大。首先，它解决了在三维、多细胞结构（尤其是难以传代的类器官）中进行高效基因组编辑的长期难题，为利用类器官模型进行疾病机制研究和药物筛选提供了强大工具。其次，CaSh-Pro展示的细胞类型特异性靶向能力，为在复杂组织中进行精准基因治疗、减少脱靶效应指明了新方向。再者，该方法能显著提升AAV的转导效率，可能有助于优化基于AAV的基因疗法策略。研究也指出，尽管基于类器官的优化为未来应用奠定了基础，但将钙休克技术应用于活体动物或人体仍面临技术挑战和安全风险，例如瞬态钙调控对全身或局部组织稳态的潜在影响，需要详尽的临床前评估。
总而言之，钙离子休克及其可编程版本为生命科学基础研究和转化医学，特别是在复杂生物系统中实现高效、精准的基因操作，提供了一套强大、灵活且颇具前景的全新工具包。
