《Advanced Science》：Size-Modulated Mesoderm-Endoderm Divergence and Myocardial Cavitation in Micropatterned Cardioids
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本研究聚焦于心脏与内胚层前肠协同发育的关键问题，研究人员利用微图案化、CRISPR工程化报告hiPSC、深度组织成像及单细胞RNA测序（scRNA-seq）等前沿技术，构建了微图案化心脏类器官（micropatterned cardioids）模型。研究阐明了中胚层-心脏与内胚层-前肠谱系的分化轨迹，揭示了尺寸依赖的细胞组成、类器官空腔形成与信号互作机制，特别是600 μm图案可形成类似早期心腔的大空腔，为理解胚胎早期心-前肠协同发育提供了新模型与机制见解。
心脏，作为哺乳动物发育过程中第一个形成并开始工作的器官，其诞生并非一场“独角戏”。在胚胎早期，心脏从中胚层发育而来，而它的“邻居”——前肠内胚层，也在同步生长。这两个“小伙伴”之间的“悄悄话”（信号交流）对彼此的正常发育至关重要。然而，它们之间具体如何“对话”，这些“对话”又如何影响心脏最终形成有腔室的结构，一直是科学家们想要破解的谜题。传统的研究模型难以精确模拟这种复杂的、多谱系协同发育的微环境。针对这一挑战，由P. H.、D. W. K.、A. K.、N. Y. M.、M. C. 等研究人员在Zhen Ma的带领下，在《Advanced Science》上发表了一项创新性研究，他们构建了一个“微图案化心脏类器官”模型，像“微雕”一样精确控制干细胞生长的初始“地盘”，以此来研究尺寸如何影响心脏与内胚层的“共舞”。
为了探究这些问题，研究者们主要运用了以下几项关键技术：首先，利用微图案化技术，在培养表面制造出直径分别为200、600和1000微米（μm）的圆形黏附区域，用以精确控制人诱导多能干细胞（hiPSC）集落的初始大小和几何形状。其次，使用了CRISPR/Cas9基因编辑技术构建的荧光报告hiPSC细胞系（如TNNI2-GFP、ACTN2-GFP，以及三报告基因RUES2-GLR hESC系），以便在活体中实时追踪特定细胞类型的出现。再者，结合组织透明化技术与双光子显微镜，实现了对整个心脏类器官内部三维结构的深度成像，可视化其空腔形成。最后，在多个时间点对类器官进行单细胞RNA测序（scRNA-seq），并结合PHATE轨迹分析、PAGA图抽象和CellChat细胞互作分析等生物信息学方法，系统重建了发育轨迹并解析了细胞间的信号通讯网络。研究所用的hiPSC系主要来源于WTC背景的健康供体，并利用了RUES2背景的胚胎干细胞系。
研究结果部分：
1. 具有新生心肌空腔的多细胞共发育心脏类器官
研究人员将hiPSC限制在600 μm的圆形图案中，成功生成了心脏类器官。通过深度组织成像，他们在类器官内部观察到了明显的空腔结构。这些空腔内衬有内皮细胞（标记物：CDH5, PECAM1）和前肠上皮细胞（标记物：HNF3α），而肝前体细胞（HNF3β+）则聚集成簇，形成了“内胚层岛”。这揭示了类器官内同时存在类似前肠管腔和内胚层肝芽的结构。
2. PHATE轨迹中的中胚层-内胚层分化
通过scRNA-seq分析覆盖分化过程多个时间点的细胞，研究人员利用PHATE算法清晰地描绘了中胚层-心脏谱系与内胚层-肝脏谱系的分化轨迹。他们鉴定出13种不同的细胞类型，不仅包括了预期的中胚层来源的心肌细胞、内皮细胞、成纤维细胞、心外膜细胞、平滑肌细胞，还包括了内胚层来源的定形内胚层、前肠上皮细胞、肝母细胞和肝间充质细胞。此外，研究还意外地在谱系之间发现了一个非神经外胚层细胞群，这表明微图案化心脏类器官中出现了三个胚层的共发育现象。
3. 谱系特异的多元细胞发育
通过对中胚层和内胚层谱系分别进行更精细的亚聚类分析，研究揭示了更详细的发育路径。在中胚层谱系，心脏中胚层逐步分化为早期和晚期心脏祖细胞，进而岔开成为心肌细胞、内皮细胞以及基质细胞（成纤维细胞、平滑肌细胞、心外膜细胞）。在内胚层谱系，肝间充质被进一步区分为三种不同发育起源的亚型：中胚层来源的间皮细胞、内胚层来源但经历上皮-间质转化的肝间充质细胞，以及肝星状细胞。这精细地模拟了肝脏发育中细胞侵袭周围间充质的复杂过程。
4. 图案尺寸对中胚层-内胚层分化的影响
通过使用三报告基因hESC系（SOX2, TBXT/Brachyury, SOX17）实时观察和scRNA-seq验证，研究发现初始图案尺寸强烈影响早期谱系分化。200 μm的小图案保留了更多的多能干细胞和原始条纹细胞，分化较慢；600 μm的中等图案更利于心脏中胚层的形成；而1000 μm的大图案则显著富集了定形内胚层。细胞通讯分析显示，中胚层来源的细胞是非经典WNT（ncWNT）、NRG和TGF-β信号的主要来源，而内胚层来源的细胞则主导VEGF和Hedgehog（HH） 信号。600 μm图案中ncWNT信号高度激活，而经典WNT信号被抑制，这有利于向心脏祖细胞转变；相反，HH信号在1000 μm图案中富集，对诱导内胚层至关重要。
5. 图案尺寸对心脏类器官空腔化的影响
空腔结构分析表明，图案尺寸同样调控着类器官的最终形态。200 μm类器官空腔形成有限；1000 μm类器官内部形成大量网状互联的小空腔；而600 μm类器官则能形成单一的、较大的中心化空腔，更类似早期心腔的形成。功能分析显示，600 μm类器官的心肌细胞表现出更强的钙处理能力。scRNA-seq显示，600 μm类器官拥有最高比例的心肌细胞（约65%），并且前肠上皮细胞与心肌细胞之间的相互作用更强。前肠上皮细胞是VEGF和NRG信号的关键来源，这些信号对血管生成和心肌空腔化/致密化至关重要。
研究结论与意义：
本研究成功建立并深入解析了“微图案化心脏类器官”这一新型模型。其主要结论是，初始的生物物理约束（图案尺寸） 通过调控细胞间的信号网络，深刻影响了中胚层与内胚层的谱系分化命运、两类细胞间的信号“对话”，并最终决定了类器官的形态发生（特别是空腔化）和功能成熟。600 μm的图案尺寸在此模型中展现出“最佳点”，能促进心脏中胚层优势分化、增强中胚层-内胚层有益互作（如NRG、ncWNT信号），并形成类似早期心腔的单一大型空腔，其心肌细胞也表现出更高的成熟度。
这项研究的重要意义在于：首先，它提供了一个强大的体外模型系统，用于研究心脏与前肠在胚胎早期的协同发育，填补了此前对中胚层-内胚层互作动态网络理解不足的空白。其次，它揭示了生物物理因素（尺寸）在器官发生中的关键作用，证明简单的几何限制足以引导复杂的多谱系自组织和形态发生，这为类器官工程和发育生物学提供了新原理。最后，研究系统鉴定了参与心-前肠互作的关键信号通路（如HH、VEGF、NRG、ncWNT），为理解相关先天性疾病的可能机制提供了线索。总之，这项工作不仅增进了对心脏发育基础原理的认识，也为利用类器官模型研究复杂器官间互作和探索组织工程策略树立了范例。
