《Journal of Virological Methods》：Indirect ELISA based on truncated N protein for detecting Porcine deltacoronavirus-specific IgA antibodies
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PDCoV检测方法的优化与ELISA建立：通过构建并表达五种重组截断PDCoV N蛋白(N1-N5)，筛选出与PEDV血清交叉反应较少的N3蛋白，结合S1蛋白建立间接ELISA检测方法。结果显示S1-ELISA和N3-ELISA灵敏度均为75%、特异性86%，检测一致性达92.3%。N蛋白的稳定性优于S蛋白，方法适用于自然感染或疫苗接种后PDCoV特异性IgA检测，为临床诊断提供新依据。
王东升|张丽萍|于瑞明|张忠旺|周鹏|白英杰|刘雅|郭慧晨|潘莉|刘新生
中国农业大学兰州兽医研究所兰州大学兽医学院动物疾病控制与预防国家重点实验室，兰州730046
摘要
猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）是一种猪肠道冠状病毒，会导致仔猪严重腹泻，对养猪业极具危害。为了有效预防该疾病，需要快速准确地检测抗体水平。我们之前已经证明PDCoV和猪流行性腹泻病毒（PEDV）的N蛋白具有血清交叉反应性。因此，在本研究中，我们首先构建并表达了五种重组截短PDCoV N蛋白（N1-N5）。通过这些蛋白与猪PDCoV阳性血清和猪PEDV阳性血清的反应性以及建立的ELISA方法，筛选出与PDCoV和PEDV血清交叉反应较少的截短蛋白，并利用这些重组截短N蛋白和PDCoV S1蛋白建立了用于IgA检测的间接酶联免疫吸附测定（ELISA）方法。以S1蛋白或截短蛋白N3（aa1-122）作为包被抗原的ELISA方法具有最高的灵敏度和特异性（S1-ELISA：灵敏度75%，特异性86%；N3-ELISA：灵敏度75%，特异性86%）。这两种方法在总共62份初乳和血清样本中检测抗PDCoV特异性IgA水平时显示出超过90%的一致性。尽管S1-ELISA和N3-ELISA的灵敏度和特异性相同，但N蛋白比S蛋白更稳定。因此，我们的ELISA方法可以用于检测自然感染或接种疫苗后的抗PDCoV特异性IgA。我们的发现为未来建立针对PDCoV的特异性临床快速诊断方法提供了重要基础。
引言
猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）是一种新兴的猪肠道冠状病毒，其临床特征与猪流行性腹泻病毒（PEDV）相似。感染后，哺乳期仔猪会出现严重的临床症状，如呕吐和腹泻，这些症状可能导致最终脱水。PDCoV于2012年首次在中国香港特别行政区（SAR）被Woo等人发现（Woo等人，2012年）。随后，2014年美国多个州的养猪场也发生了疫情（Homwong等人，2016年；Sinha等人，2015年；Wang等人，2014年）。近年来，PDCoV感染已在包括老挝、越南、日本、加拿大、韩国、泰国和中国在内的地区被报道（Janetanakit等人，2016年；Lorsirigool等人，2016年；Niederwerder和Hesse，2018年；Saeng-Chuto等人，2017年；Song和Park，2012年；Suzuki等人，2018年；Zhang等人，2019年），并对养猪业造成了严重的经济损失（Ma等人，2015年）。此外，PDCoV还可以感染犊牛和家禽；可引起鸡和火鸡的腹泻症状（Boley等人，2020年；Jung等人，2017年；Lednicky等人，2021a年）；并且可以感染人类细胞（Liang等人，2019年）。2021年，在三名患有急性发热疾病的儿童血液中检测到了PDCoV核酸序列（Li等人，2018年）。因此，PDCoV是一种潜在的高风险新型猪冠状病毒，可能威胁人类健康和公共安全。
PDCoV属于冠状病毒科（Coronaviridae）中的冠状病毒属（Chen等人，2014年；He等人，2014年；Lau等人，2012年）。这种单链正链RNA病毒的球形颗粒大小约为100纳米（Jung等人，2016年）。PDCoV基因组大小约为25.4 kb（Zhang，2016年），编码四种结构蛋白：刺突蛋白（S）、膜蛋白（M）、包膜蛋白（E）和核衣壳蛋白（N）（Wang等人，2019年）。其中，S蛋白负责病毒与细胞受体的结合，从而介导病毒的侵入和感染。由于S蛋白能诱导机体产生中和抗体，因此它是开发PDCoV疫苗的重要靶点（Lee和Lee，2015年；Shang等人，2018年；Wang等人，2016年）。N蛋白含量最高，常用于建立PDCoV诊断方法（Zhang等人，2020年）。
PDCoV主要感染仔猪的肠道（Fang等人，2018年），新生仔猪的抗体保护主要通过肠道-乳腺-IgA轴分泌到母体初乳和乳汁中实现（Jung等人，2014年）。分泌型免疫球蛋白A（sIgA）通过中和病毒并阻止病毒侵入肠上皮细胞，在肠道黏膜免疫中起重要作用。因此，PDCoV特异性sIgA水平是评估仔猪被动免疫水平的重要指标（Langel等人，2016年）。
以往的PDCoV酶联免疫吸附测定（ELISA）方法，包括间接ELISA（Langel等人，2020年）、竞争性ELISA（Langel等人，2016年）和阻断ELISA（Langel等人，2020年），主要基于PDCoV的S蛋白和N蛋白。然而，这些基于不同抗原的方法之间的差异尚不清楚。此外，我们之前的研究表明，PDCoV和PEDV N蛋白之间的交叉反应会影响检测准确性（Wang等人，2025年）。因此，在本研究中，为了尽可能减少PDCoV和PEDV N蛋白之间的交叉反应，我们模拟了PDCoV N蛋白的三维结构并将其截短，制备了多种截短PDCoV N蛋白。然后，我们比较并分析了基于PDCoV S1蛋白和N蛋白的间接ELISA方法之间的差异。最终，我们建立了一种具有高灵敏度和良好特异性的间接ELISA方法用于IgA检测。
部分内容片段
血清、抗体和病毒
我们实验室分离并保存了PDCoV CH/XJYN/2016（登录号：MN064712）菌株。LLC-PK1（ATCC，CL-101）从美国典型培养物收藏中心（ATCC）购买。真核表达质粒、一些原核表达质粒和肽由GenScript（南京）有限公司合成。PEDV、猪轮状病毒（PoRV）、传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪圆环病毒（PCV）、经典猪瘟病毒（CSFV）等病毒的相关序列也进行了合成。
讨论
PDCoV是一种新发现的冠状病毒，不仅对养猪业构成严重威胁，还会感染多种哺乳动物和鸟类（Wang等人，2022年；Yu等人，2025年）。更重要的是，PDCoV已被证明可以感染人类，并与海地儿童的急性未分化发热疾病有关（Hu等人，2020年）。因此，PDCOV具有跨物种传播的潜力，存在人畜共患风险。作为猪冠状病毒的PDCOV的临床特征...
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文所述的工作。
资助
本研究得到了甘肃省重大科技项目（项目编号24ZD13NA008和23ZDNA007）、国家生猪技术创新中心（NCTIP-XD/C 03）和中国农业研究系统的支持（项目编号CARS-35）。
CRediT作者贡献声明
王东升：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，验证，方法学，数据管理。于瑞明：方法学。张丽萍：方法学，正式分析，数据管理。周鹏：方法学，研究。张忠旺：研究。刘雅：验证，监督。白英杰：验证，监督。潘莉：验证，监督。郭慧晨：验证，监督。刘新生：撰写 – 审稿与编辑，可视化，监督，资源管理。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文所述的工作。
