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为解决低温发酵肉制品风味不足、现有商业发酵剂低温适应性差等问题，研究人员从臭豆酱中筛选低温耐高蛋白酶活性酵母，发现Yarrowia parophoni Q3-6菌株可靶向水解肌浆蛋白，显著提升TCA可溶性肽、游离氨基酸及醛、醇、酮等挥发性风味物质含量，为开发低温肉制品发酵剂、提升产品风味品质提供理论依据。
想象一块经过精心熟成的牛肉，其浓郁的风味和独特的口感令人回味无穷。这类发酵肉制品的美味，很大程度上归功于在特定温湿度条件下，微生物或酶对肉中蛋白质和脂肪的转化。然而，目前许多发酵肉制品仍依赖传统的自然发酵方法，生产周期长、成本高，且易受有害微生物污染，难以满足大规模市场需求。更重要的是，对于需要在低温（如0-4°C）下进行的干式熟成等工艺，大多数商业发酵剂中的蛋白酶活性会因低温而受到显著抑制，这严重限制了低温发酵肉制品的风味发展和工业化应用。因此，寻找并利用那些既能在低温下旺盛生长，又能高效水解蛋白质、产生丰富风味前体物质的微生物，成为提升低温发酵肉制品品质的关键。
为了突破这一瓶颈，一项创新性的研究将目光投向了传统发酵食品——臭豆酱。臭豆酱是中国朝鲜族的传统大豆发酵食品，富含蛋白质和包括酵母在内的多种微生物。研究者提出从这一传统发酵剂中“筛选功能菌株”的策略，旨在挖掘其中耐低温的酵母资源，以功能性地补充肉制品内源酶系的不足。他们的核心目标是筛选出蛋白酶活性高、不产生硫化氢、能在4°C生长，并能有效水解肉蛋白（特别是肌浆蛋白）的酵母菌株，从而开发出能增强风味、适用于低温肉制品生产的发酵剂。
这项研究已发表在《LWT - Food Science and Technology》期刊上。为了开展研究，研究人员运用了几个关键的技术方法：首先，他们从市售臭豆酱样本中分离酵母，并通过在含脱脂乳的培养基上观察水解圈进行初筛。接着，对初筛菌株进行安全性（不产硫化氢、溶血实验）、蛋白酶活性测定以及在4°C下的生长能力测试等复筛。随后，将优选菌株接种至以牛臀肉肌浆蛋白提取物建立的模拟发酵体系中进行低温（4°C）发酵。研究过程中，主要监测了酵母菌落数、pH值、TCA可溶性肽含量，并采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）分析蛋白水解情况。利用高效液相色谱（HPLC）测定游离氨基酸（FAA）组成与含量，通过顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（HS-SPME-GC-MS）技术鉴定挥发性风味物质，并计算气味活度值（OAV）以评估关键风味成分。最后，通过ITS DNA测序对优选菌株进行分子鉴定。
3.1. 蛋白酶产酵母的分离与初筛
研究人员使用含脱脂乳的酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）固体培养基，从臭豆酱中初步筛选出30株能形成透明水解圈的酵母菌株，并通过测量水解圈直径评估其产蛋白酶能力。其中，菌株Q3-6的水解圈直径最大，显示其具有较强的蛋白酶产生潜力。
3.2. 蛋白酶产酵母的复筛
3.2.1. 安全实验
所有30株酵母的硫化氢产生实验和溶血实验结果均为阴性，表明它们不产生带来不良风味的硫化氢，且无溶血活性，符合食品安全初步要求。
3.2.2. 蛋白酶活性
测定显示，菌株Q3-6在4°C下的蛋白酶活性最高，达到20.46 katal。Q2-1、Q2-3、Q2-5、Q3-7和Q4-2等菌株也表现出较强的蛋白酶活性。
3.2.3. 酵母在4°C生长能力的测定
在4°C低温培养下，菌株Q2-1、Q2-3、Q2-5和Q3-6表现出较好的生长速度和较高的最终菌体密度（OD600值），显示出良好的低温适应性。其中Q3-6生长稳定。
3.3. 酵母菌落数测定
在肌浆蛋白模拟发酵体系中，接种的各实验组酵母数量在发酵期间保持稳定或略有增长，发酵体系无菌条件良好。
3.4. pH值的变化
与对照组相比，所有接种酵母的发酵液pH值均随着发酵时间显著下降，发酵结束时均降至4.66以下，其中Q3-6组pH降至4.51。这表明酵母代谢利用了体系中的碳水化合物，产生了酸性物质。
3.5. TCA可溶性肽含量的变化
经过7天发酵，所有接种组的TCA可溶性肽含量均显著增加。其中，Q3-6组的含量最高，达到7.36 mg/L，约为对照组的三倍，表明该菌株能有效促进蛋白质水解，产生更多小分子肽。
3.6. SDS-PAGE
蛋白质电泳图谱显示，与对照组相比，各接种组的肌浆蛋白条带在20-135 kDa区域有明显减少或消失，并在17-20 kDa区域出现大量小分子条带。特别是Q3-6接种组中，分子量约为48 kDa和63 kDa的蛋白质条带（推测分别为肌酸激酶M型和甘油醛-3-磷酸脱氢酶）降解最为显著，进一步证实了Q3-6菌株强大的蛋白质水解能力。
3.7. 游离氨基酸含量
发酵后，各接种组的总游离氨基酸含量均显著高于对照组。Q3-6组的总游离氨基酸含量最高，达到40.19 mg/100mL。尤其值得注意的是，与风味前体密切相关的苦味氨基酸（如亮氨酸、酪氨酸）和甜味氨基酸（如苏氨酸、甘氨酸）等在Q3-6组中含量显著提升，这些氨基酸是后续形成挥发性风味物质的重要前体。
3.8. 挥发性风味化合物的变化
通过GC-MS分析，在接种不同酵母的发酵液中鉴定出醛、醇、酸、酮、酯和烷烃等六大类挥发性风味化合物。其中，Q3-6组检测到的风味物质种类最多（33种）。与对照组相比，Q3-6接种显著增加了醛类（如具有果香的2-甲基戊醛、柑橘皮香气的癸醛）、醇类（如具有麦芽和果香的3-甲基-1-丁醇）、酮类（如具有特征性奶油糖果香气的3-羟基-2-丁酮）等关键风味物质的相对含量。这些物质共同贡献了发酵体系更丰富、更有层次的“果香”、“花香”和“干腌”类香气。
3.9. 基于OAV值计算筛选关键挥发性化合物
通过计算气味活度值（OAV），发现癸醛和1-辛醇是OAV大于1的关键挥发性化合物。在Q3-6组中，这两种物质的OAV值最高，表明它们对该发酵体系整体香气的贡献最为突出，证实了接种高产蛋白酶酵母能有效富集肌浆蛋白的风味。
3.10. 菌株鉴定
通过对综合表现最优的Q3-6菌株进行ITS DNA序列分析，并构建系统发育树，最终将其鉴定为Yarrowia parophoni。
本研究得出结论，从臭豆酱中筛选得到的Yarrowia parophoni Q3-6是一株具有高蛋白酶活性和优异低温适应性的酵母菌株。在牛肉肌浆蛋白低温发酵模型中，该菌株能实现靶向性蛋白水解，显著提升TCA可溶性肽和总游离氨基酸的含量，并有效富集醛类、醇类、酮类等多种关键挥发性风味物质，从而全面增强发酵体系的滋味和香气特征。这项工作不仅为开发新型耐低温肉制品发酵剂提供了优异的候选菌种，也深化了对酵母在低温下调控肉蛋白水解与风味形成机制的理解。研究人员指出，该菌株后续可应用于干式熟成牛肉等实际产品中，以验证其具体功能效果，这为通过微生物发酵策略提升发酵肉制品品质、推动产业升级提供了重要的理论基础和应用前景。
