《Advanced Healthcare Materials》：Paracrine Factor Local Gradient-Generating System for Engineering Perfusable Vascularized Hepatocyte Tissues with Perfusion-Induced Proliferation
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本研究针对供体肝脏短缺和体外构建功能性肝组织的难题，开发了一种旁分泌因子局部梯度（PFLG）生成系统。该系统通过整合人肺成纤维细胞（hLF）负载的低温凝胶与微流控装置，在肝细胞接种前引导血管生成，成功构建了可灌注、血管化的肝细胞组织。研究表明，该平台不仅能重现体内肝窦结构的肝细胞-内皮细胞紧密接触，增强肝细胞极性和胆汁毛细管功能，更重要的是，在灌注培养条件下能够有效诱导肝细胞（rHep）重新进入细胞周期并显著增殖，同时维持细胞极性。这项研究为体外构建可移植的功能性肝脏组织奠定了重要基础。
肝脏是人体重要的代谢和解毒器官，但晚期肝病的唯一根治性疗法——肝移植，却长期面临供体器官严重短缺的困境。这催生了科学家们在体外“制造”功能性肝脏组织的梦想。然而，将实验室中的肝细胞变成一块可供移植的、有生命力的肝组织，面临着几大难以逾越的“高墙”。首先，体外培养的肝细胞（尤其是原代肝细胞）很快就会失去其特有的功能和活性。其次，一块“活”的组织必须有血液供应，即血管系统，否则内部的细胞会因缺乏养分和氧气而坏死。在肝脏中，肝细胞与特化的肝窦内皮细胞（SECs）紧密相依，形成高效的“肝窦”结构，这是物质交换和功能维持的解剖学基础。如何在体外重建这种精密的血管网络，并让血管真正“长入”肝细胞团块内部，是当前肝脏组织工程的核心瓶颈。更棘手的是，肝脏具有强大的再生能力，但体外培养的肝细胞却仿佛进入了“休眠”状态，几乎不增殖。如何唤醒它们的增殖潜能，是实现组织规模扩增、走向临床应用的关键。虽然以往的研究通过添加生长因子、利用微流控装置或共培养内皮细胞等方式取得了一定进展，但往往难以同时实现血管的深度穿透、功能性灌注以及在不损失分化功能的前提下诱导肝细胞再生。
为了解决上述挑战，发表在《Advanced Healthcare Materials》上的一项研究带来了新的曙光。研究人员开发了一个创新的、模块化的“旁分泌因子局部梯度（PFLG）生成系统”，旨在构建可灌注的血管化肝细胞组织，并模拟体内由血流灌注触发的肝细胞再生过程。
这项研究主要采用了以下几个关键技术方法：首先，研究人员制备了具有多孔结构的人肺成纤维细胞（hLF）负载的明胶低温凝胶，作为旁分泌因子的持续释放源。其次，使用了定制化的三通道微流控装置作为组织培养的物理空间框架。研究的核心策略是“先血管化，后种肝细胞”的两阶段法：第一阶段（预血管生成阶段），在无肝细胞的情况下，利用hLF低温凝胶产生的PFLG引导人脐静脉内皮细胞（HUVECs）在装置内形成初步的微血管网络；第二阶段（血管化阶段），将大鼠原代肝细胞（rHeps）与HUVECs按优化比例混合，接种到另一通道，此时已存在的微血管会在PFLG的持续引导下向肝细胞组织内生长并最终穿透。最后，通过施加可控的流体静压（如1或2 mmH2O）进行灌注培养，以研究灌注对肝细胞功能与增殖的影响。研究所用的大鼠原代肝细胞（rHeps）来源于雄性Sprague-Dawley大鼠。
研究结果
2.1 hLF在明胶低温凝胶内的培养表征
研究人员首先证实，制备的明胶低温凝胶具有相互连通的孔状结构，平均孔径约为62.4 μm，能为hLF提供良好的附着和生长微环境。hLF在凝胶内可长期保持高活力和代谢活性，并持续增殖，这确保了其能作为旁分泌因子的稳定来源。
2.2 基于低温凝胶内初始hLF细胞密度的血管生成反应优化
在预血管生成阶段，研究人员发现，由hLF产生的PFLG强度与凝胶内初始hLF密度呈正相关。当hLF密度为40,000个/凝胶时，诱导形成的微血管网络具有最佳的血管面积和长度密度。密度过高（60,000个/凝胶）反而会导致血管融合，破坏网络结构。因此，后续实验选择40,000个/凝胶作为优化条件。
2.3 依赖于rHep与HUVEC比例的肝细胞组织血管化
在血管化阶段，研究人员测试了不同的肝细胞与内皮细胞混合比例。结果显示，当rHep:HUVEC比例为9:1时，肝细胞组织内穿透的微血管数量最多，组织结构最佳。比例过高（10:0，无HUVEC）无法形成穿透血管；比例过低（8:2）则导致内皮细胞过度聚集，反而不利于血管的有效穿透。
2.4 血管化肝细胞组织重现肝窦状肝细胞-内皮细胞接触结构
通过免疫荧光和三维成像技术证实，在该系统下构建的血管化肝细胞组织中，微血管能够完全穿透整个肝细胞组织的厚度。在横截面上可以清晰看到，微血管管腔被肝细胞紧密包围，重现了体内肝窦中肝细胞与内皮细胞直接接触的特有结构。此外，肝细胞间出现了双层F-肌动蛋白结构，提示肝细胞极性的恢复。
2.5 血管化肝细胞组织中的肝细胞极性和功能
功能评估表明，血管化显著增强了肝细胞的极性。多药耐药相关蛋白2（MRP2，一种胆汁毛细管标志物）在血管化组织中的表达面积比显著高于非血管化对照组。利用活细胞染料CellTracker Red CMTPX进行示踪，直接观察到了功能性的胆汁毛细管形成及染料向其内的排泄过程。在合成与代谢功能上，血管化组织表现出持续升高的白蛋白分泌和尿素合成能力，而非血管化组织的功能则随培养时间下降。
2.6 血管化肝细胞组织的功能性灌注分析
研究通过灌注荧光微珠（直径1 μm）和70 kDa FITC-葡聚糖证实了构建的微血管网络具有功能性灌注能力。时间推移成像显示，荧光微珠可在穿透肝细胞组织的微血管内流动。葡聚糖灌注实验进一步显示，大分子物质可以有效地从微血管渗漏并累积在肝细胞组织区域，证明了该血管系统的物质交换功能。
2.7 灌注条件下体外诱导活跃的rHep增殖活性
这是本研究最关键的发现之一。在静态培养条件下，血管化组织中的肝细胞仅有少量增殖（Ki67阳性）。然而，当施加灌注（1 mmH2O流体静压）后，肝细胞的增殖活性被显著激活，Ki67阳性肝细胞比例大幅增加，甚至在培养第7天观察到了正在进行有丝分裂的肝细胞。值得注意的是，这些增殖中的肝细胞仍然保持着相邻细胞间的双层F-肌动蛋白结构（提示极性维持）。在更高的灌注压力下（2 mmH2O），第5天的增殖活性进一步增强，但第7天略有下降。这强有力地证明，由灌注介导的力学刺激（如剪切应力）是诱导肝细胞重新进入细胞周期、同时保持其分化功能的关键因素。
结论与讨论
本研究成功开发了一个模块化、可编程的PFLG生成平台。该平台的核心优势在于能够时空可控地提供旁分泌信号和力学刺激：首先利用hLF低温凝胶产生的持续PFLG引导预血管生成和微血管定向穿透；随后通过物理移除凝胶并施加灌注，切换为以力学刺激为主导的培养模式，从而模拟体内肝再生过程中血流增加触发肝细胞增殖的生理过程。
研究得出的核心结论是：该系统能够构建出具有可灌注微血管、并重现肝窦结构的血管化肝细胞组织。这种结构不仅显著增强了肝细胞的极性和功能（如白蛋白分泌、尿素合成和胆汁排泄），更重要的是，在灌注培养条件下能够有效诱导原代肝细胞发生显著的增殖反应，且增殖中的细胞仍能维持其极性特征。这突破了体外肝细胞“增殖即去分化”的传统困境。
其重要意义在于：该研究首次在体外同时实现了肝细胞组织的功能性血管化、高效物质交换以及在不损失细胞极性前提下的灌注诱导性增殖。这为解决肝脏组织工程中血管整合和规模扩增的两大根本性难题提供了创新性的解决方案和技术平台。尽管在向人类肝细胞转化、优化灌注条件以完全保护肝细胞免受剪切损伤等方面仍需进一步探索，但这项工作无疑为未来构建可用于移植或药物测试的规模化、功能性工程肝组织奠定了坚实的技术和理论基础。
