《iMeta》：Spatial multi-omics identifies a NOTCH3-mediated capillary–mCAF crosstalk driving immune exclusion in hepatocellular carcinoma
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本研究利用高分辨率空间多组学技术，结合泛癌单细胞分析，揭示了肝癌中由毛细血管内皮细胞DLL4驱动的NOTCH3信号通路如何促进基质成纤维细胞(mCAF)极化，进而重塑细胞外基质、形成免疫排斥微环境并导致免疫检查点抑制剂(ICB)耐药的分子机制。靶向该轴可有效破坏纤维化屏障、增强T细胞浸润，并与抗PD-1疗法产生协同作用，为克服肝癌免疫治疗耐药提供了有前景的靶向策略。
肝细胞癌是全球范围内最常见的原发性肝癌，也是导致癌症相关死亡的主要原因之一。其一个标志性的病理特征是显著的纤维化或肝硬化，这通常源于潜在的慢性肝病，如病毒性肝炎、酒精性肝损伤和非酒精性脂肪性肝炎。这种纤维化背景不仅促进肿瘤进展，还深刻改变了肿瘤微环境的空间结构，影响了疾病的进程和治疗反应。在这一复杂的微环境中，癌症相关成纤维细胞是细胞外基质重塑和免疫调节的关键“建筑师”。然而，以往的研究在分辨率和多重检测能力上存在局限，阻碍了对人类肝癌空间细胞图谱的详细描绘，也限制了对CAF极化状态及其与免疫、血管成分空间协调互作的深入研究。一个核心的科学问题悬而未决：不同的CAF亚型（如基质产生型CAF和炎症型CAF）的功能性极化，是否建立了由基质驱动的检查点，从而导致免疫逃逸？鉴于肝癌发生在以纤维化为主导的微环境中，阐明血管信号如何影响CAF分化，可能为理解纤维化、免疫排斥和疗法抵抗之间的联系提供关键见解，从而识别潜在的基质靶向干预策略。
这项发表于《iMeta》的研究，正是为了解答这些问题。研究人员采用了CosMx?空间分子成像仪这一新一代空间转录组学平台，对来自45名患者的154个组织微阵列核心进行了高分辨率分析，并结合了接受免疫检查点阻断治疗的泛癌CAF单细胞RNA测序数据，系统性地描绘了肝癌的生态系统。
研究人员主要运用了以下关键技术方法：1. 高分辨率空间转录组学，使用CosMx? SMI 1000-plex和6000-plex panel对福尔马林固定石蜡包埋的肝癌样本进行单细胞水平空间转录组分析。2. 空间蛋白质组学，利用GeoMx数字空间分析技术对570种蛋白质进行空间原位表达谱分析。3. 公共数据库整合分析，整合了来自169名接受免疫检查点阻断治疗患者的泛癌单细胞RNA测序数据，对CAF异质性进行跨癌种分析。4. 体外与体内功能验证，包括细胞共培养、基因敲除、以及使用原位植入和自发两种小鼠肝癌模型进行的药理学干预实验。
研究结果
单细胞空间转录组谱揭示肝癌中协调的细胞拓扑结构
通过构建高分辨率空间多组学图谱，研究鉴定出8个主要细胞谱系。分析发现，星状细胞（即CAF）和T/NK细胞在肿瘤边界显著富集，提示CAF的聚集可能在侵袭前沿排斥T细胞向肿瘤微环境的浸润。空间邻域分析进一步揭示了九个不同的空间生态位，其中“mCAF_胆管”生态位（mCAF与胆管细胞共定位）的丰度与较差的总生存期和无进展生存期显著相关，暗示了通过基质-上皮互作促进肿瘤的作用。
CAF极化和空间偏好可作为肝癌预后的潜在指标
研究在空间转录组数据中系统分类出6个CAF亚群：基质产生型CAF、炎症型CAF、抗原呈递型CAF、血管型CAF、增殖型CAF和周细胞。其中，iCAF主要富集于癌旁正常组织，而mCAF优先聚集在肿瘤核心和侵袭边缘。功能上，mCAF与细胞外基质重塑通路相关，而iCAF则与适应性免疫应答相关。临床关联分析显示，高mCAF浸润有更差生存期的趋势，而高iCAF则与良好预后相关。空间蛋白质组学结果进一步证实了这些区域特异性的免疫和基质动态。
肝窦内皮细胞来源的DLL4触发mCAF中NOTCH3激活和ICB耐药
通过整合泛癌单细胞数据分析，研究发现对免疫检查点阻断无应答的患者中mCAF比例显著更高。差异表达基因分析一致地将NOTCH3鉴定为mCAF的稳健标记物。细胞间通讯分析揭示了毛细血管与mCAF之间NOTCH信号通路的显著激活，主要由DLL4/NOTCH3、JAG1/NOTCH3和DLL1/NOTCH3相互作用介导。其中，DLL4几乎只在内皮细胞中表达。空间共定位分析、GeoMx蛋白质组学及相关性分析均支持DLL4-NOTCH3轴在驱动mCAF极化中的关键作用。泛癌分析还发现，对免疫检查点阻断无应答者的内皮细胞中DLL4表达显著更高。
mCAF极化在体外增强纤维化和免疫排斥
根据免疫细胞浸润水平对视野进行分层，发现大多数mCAF特征基因与免疫细胞浸润减少相关。在人肝星状细胞系LX-2中敲除NOTCH3，可富集与T细胞激活和增殖相关的基因特征。与NOTCH3缺陷的LX-2细胞共培养，可增加CD8+T细胞的迁移和细胞毒性因子分泌。DLL4刺激实验证实，DLL4-NOTCH3轴的激活可上调胶原相关基因表达，促进纤维化表型。
mCAF与单核/巨噬细胞互动塑造免疫抑制性肿瘤微环境
空间分析显示，iCAF在癌旁正常区域与CD8+T细胞优先共定位，并通过CCL19/CCL21-CCR7等信号互作。而mCAF则通过TGF-β信号对CD8+T细胞表现出更强的免疫抑制作用，且mCAF高组中免疫检查点基因表达上调。此外，研究还发现mCAF的积累与巨噬细胞的募集呈强相关，并且mCAF表达的胶原蛋白、APP和FN1等可通过CD44和CD74与巨噬细胞发生强相互作用，可能共同塑造免疫耗竭的微环境。
NOTCH3抑制通过增强体内免疫激活来增强抗PD-1疗效
在两种小鼠肝癌模型（原位植入模型和自发模型）中，使用γ-分泌酶抑制剂DAPT（一种NOTCH通路抑制剂）扰动NOTCH信号。结果显示，DAPT与抗PD-1抗体联合治疗可显著降低肿瘤负荷，并增强肿瘤内CD8+T细胞的细胞毒活性，同时伴随免疫细胞浸润增加、肝纤维化减少和肿瘤坏死加剧。细胞因子分析也表明联合治疗组改变了免疫抑制状态。
结论与讨论
本研究通过整合高分辨率空间多组学与泛癌单细胞数据，系统描绘了肝癌中CAF的空间架构、功能极化及临床意义。其核心发现是揭示了一条由毛细血管内皮细胞来源的DLL4激活mCAF中NOTCH3，从而驱动mCAF极化、形成免疫限制性生态位、限制T细胞浸润并促进纤维化的全新信号轴。这一发现将血管线索与基质重塑及免疫排斥联系了起来。与以往研究相比，本研究不仅验证了具有侵袭性基质重塑能力的mCAF和具有免疫调节功能的iCAF，更重要的是，其应用的单细胞分辨率空间技术克服了以往区域混合分析的局限，精确绘制了CAF生态位的空间分隔，这些生态位是构成“免疫热”与“免疫冷”微环境的结构决定因素。在机制上，研究发现了不同于经典TGF-β信号、驱动mCAf极化的新型内皮-CAF轴，并锁定肝窦内皮细胞来源的DLL4是激活成纤维细胞NOTCH3、强化免疫排斥的特异性配体。针对此轴的干预（如使用DAPT）在临床前模型中显示出与免疫检查点阻断疗法的协同效应，能有效破坏纤维化屏障、增强T细胞浸润和抗肿瘤免疫，为将抗纤维化与免疫治疗相结合的联合策略提供了强有力的理论依据和极具潜力的治疗靶点。尽管使用的DAPT是泛NOTCH抑制剂，但多组学数据一致指向NOTCH3的核心角色。未来使用NOTCH3特异性抑制剂等工具进行验证，将能更明确其因果关系和转化潜力。总之，这项工作强调了CAF极化在塑造肝癌免疫景观中的关键作用，并将NOTCH通路，特别是DLL4-NOTCH3轴，确立为一个可干预治疗的新靶点，为改善肝癌患者预后开辟了新的途径。
