《Journal of Extracellular Vesicles》：The Fatty Acid Transporter CD36 Mediates Uptake, Biodistribution, and Cardioprotection by Small Extracellular Vesicles From HEK293 Cells
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细胞外囊泡（EVs）在心肌梗死（MI）中显示出治疗潜力，但其体内摄取和分布机制尚不完全明确。本研究探讨了脂肪酸转运蛋白CD36在介导HEK293细胞来源的小细胞外囊泡（sEVs）被心肌细胞和内皮细胞摄取、体内生物分布以及其在小鼠心肌缺血再灌注（I/R）损伤模型中发挥心脏保护作用中的关键角色。研究发现，CD36是sEVs发挥功能的关键介质，这为sEVs治疗心肌梗死提供了新的机制见解和潜在靶点。
当我们谈论心脏病发作，也就是心肌梗死时，时间就是心肌，时间就是生命。尽管医学在不断进步，但寻找能够有效保护心肌、缩小梗死面积的新疗法，仍然是心血管领域迫切的挑战。近年来，一类名为“细胞外囊泡”的纳米级信使进入了科学家们的视野。这些由细胞分泌的微小包裹，携带着蛋白质、核酸和脂质等“货物”，能够在细胞间传递信息，调节生理和病理过程。其中，直径小于200纳米的小细胞外囊泡（small extracellular vesicles, sEVs）尤其令人感兴趣，因为已有研究表明它们在不同疾病模型中具有治疗潜力，包括能够减轻心肌梗死后的损伤。
然而，要将sEVs安全有效地转化为临床疗法，我们必须先成为合格的“快递员”，清楚地知道这些“包裹”被谁签收、在身体里如何运送、以及最终如何发挥作用。目前，关于sEVs被心脏细胞摄取的分子机制，以及它们在活体内的分布和命运，仍然存在许多未知。特别是，sEVs表面的哪些“地址标签”被心脏细胞识别，从而打开“收货大门”，是一个关键的科学问题。
为了解决这些问题，由Sean M. Davidson、Elias Sulaiman和Derek M. Yellon领导的研究团队进行了一项深入探索。他们的目光聚焦于一个名为CD36的分子。CD36是一种清道夫受体，广泛表达于内皮细胞、巨噬细胞和心肌细胞表面，因其能够结合并内化氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）和某些脂肪酸（如磷脂酰丝氨酸PS和磷脂酰胆碱）而闻名。有趣的是，PS正是sEVs膜脂的重要成分。那么，CD36这个“门卫”，是否会因为认出了sEVs膜上的PS这个“通行证”，而允许其进入心脏细胞呢？这种识别是否又决定了sEVs能否发挥保护心脏的作用？
为了验证这个假说，研究人员选择了HEK293（人胚胎肾293）细胞作为sEVs的生产工厂。尽管HEK293细胞本身并不具有已知的促血管生成或再生特性，但作为常用的生物工程平台，它能高效地产出sEVs，这有助于剥离细胞复杂生物学背景，更纯粹地研究sEVs载体本身的作用。他们将HEK293细胞改造，使其分泌的sEVs表面携带一种发光报告基因——NanoLuc荧光素酶（NanoLuciferase, Nluc）。这样一来，这些sEVs就变成了自带“GPS信号”的追踪器，无论被细胞摄取还是在动物体内分布，都能通过检测发光信号来精确定位。
本研究主要采用了以下关键技术方法：首先，通过切向流过滤（TFF）结合尺寸排阻色谱法（SEC）从HEK293细胞条件培养基中纯化出高纯度sEVs，并利用纳米颗粒跟踪分析（NTA）、蛋白检测和DELFIA（解离增强镧系元素荧光免疫测定）法对其进行物理和生化表征。其次，在体外，将不同数量的Nluc标记的sEVs与人心肌微血管内皮细胞（HCMEC）、人冠状动脉内皮细胞（HCAEC）、人脐静脉内皮细胞（HUVEC）以及从成年大鼠分离的原代心肌细胞共培养，通过检测细胞内的Nluc活性来定量sEVs的摄取情况，并使用CD36抑制剂磺基琥珀酰亚胺油酸酯（sulfosuccinimidyl oleate, SSO）和网格蛋白介导的内存作用抑制剂氯丙嗪（chlorpromazine, CPZ）探讨摄取机制。同时，通过共聚焦显微镜对荧光染料标记的sEVs进行成像观察。在体内，向健康C57BL/6小鼠静脉注射Nluc标记的sEVs，1小时后收集主要器官和体液，通过检测Nluc活性来研究其生物分布，并评估全身灌注对分布信号的影响。最后，也是最关键的部分，在小鼠急性心肌缺血再灌注损伤模型中，于再灌注开始时静脉注射sEVs，2小时后评估心肌梗死面积，并通过预先给予SSO来探究CD36抑制对sEVs心脏保护作用的影响。
3.1 HEK293-sEVs的分离与表征
研究人员成功从HEK293细胞培养基中分离出高纯度的sEVs。纳米颗粒跟踪分析显示，其主要粒径分布在108纳米左右，且富含sEVs标志蛋白CD9、CD63和CD81。这些sEVs被高效地标记上了NanoLuc，便于后续追踪。
3.2 心脏内皮细胞比心肌细胞更快地摄取sEVs
体外实验揭示了一个重要现象：三种类型的人心脏内皮细胞（HCAEC、HCMEC、HUVEC）都能快速摄取sEVs，在4小时内达到峰值。相比之下，成年大鼠原代心肌细胞对sEVs的摄取则缓慢得多，高水平摄取需要长达24小时。这表明，在体循环中sEVs半衰期极短（约5分钟）的情况下，心脏内皮细胞可能是sEVs更重要的初始作用靶点。
3.3 CD36脂肪酸转运蛋白介导sEVs的细胞摄取
为了验证CD36的作用，研究人员在细胞摄取实验前，用SSO预处理细胞以抑制CD36。结果显示，SSO处理显著降低了HCMEC和心肌细胞对sEVs的摄取。在HCMEC中，同时抑制CD36和网格蛋白介导的内存作用，对sEVs摄取的抑制具有叠加效应，提示CD36可能通过独立于经典内存途径的机制发挥作用。而在心肌细胞中，抑制网格蛋白途径则未影响sEVs摄取。
3.4 CD36在sEVs体内生物分布中的作用
体内生物分布实验表明，静脉注射的HEK293-sEVs在1小时内迅速从血液中清除，主要聚集在肺、肝和脾脏。值得注意的是，对小鼠进行全身盐水灌注后，肺和肝脏中的发光信号显著降低，说明有很大一部分sEVs实际上滞留在器官血管腔内，而非被组织细胞真正内化。更重要的是，当用SSO系统性地抑制CD36后，sEVs在肺部的积聚显著减少，这直接证明CD36参与了sEVs在体内的组织分布。
3.5 HEK293-sEVs在急性I/R损伤小鼠模型中具有心脏保护作用
在心肌梗死模型中，于再灌注开始时注射HEK293-sEVs，能够显著减小梗死面积（从58% ± 8% 降至 36% ± 3%）。这一发现意义重大，因为它表明即使来自像HEK293这样“生物学惰性”的细胞，其sEVs也可能具有治疗心肌损伤的潜力。
3.6 CD36抑制消除了HEK293-sEVs在I/R中的心脏保护作用
最关键的一环得到了证实：当用SSO预先抑制CD36后，HEK293-sEVs所展现的心脏保护作用被完全取消。而单独使用SSO并不影响基线梗死面积。这强有力地证明，CD36介导的sEVs识别和/或摄取，是其发挥心脏保护功能的必要条件。
研究结论与意义
本研究系统阐明了HEK293细胞来源sEVs的体内外行为及其心脏保护机制，并首次明确将脂肪酸转运蛋白CD36鉴定为这一过程的关键介质。结论可归纳为以下几点：
- 1.
心脏内皮细胞是sEVs快速作用的主要靶点：与心肌细胞相比，内皮细胞能更高效、更快速地摄取sEVs，提示血管内皮系统可能在sEVs的急性心脏保护中扮演“第一响应者”和信号传导枢纽的角色。
- 2.
CD36是sEVs被心脏细胞摄取的关键受体：体外实验证实，抑制CD36可减少内皮细胞和心肌细胞对sEVs的内化。在体内，CD36也影响sEVs在主要器官（如肺）的分布。
- 3.
HEK293-sEVs具有显著的心脏保护效力：研究首次证明，来源于非干细胞/祖细胞的HEK293-sEVs，能在急性心肌缺血再灌注损伤模型中有效缩小梗死面积，拓展了具有治疗潜力sEVs的来源范围。
- 4.
CD36是sEVs发挥心脏保护作用的必要环节：核心发现在于，通过药理学手段阻断CD36，能够完全逆转HEK293-sEVs的心脏保护效益。这表明sEVs通过CD36依赖的途径传递保护信号，CD36是其发挥功能的“分子开关”。
- 5.
对sEVs生物分布研究提供了方法学启示：研究发现，体内生物分布实验中，未进行血管灌注的器官信号可能高估了sEVs的实际细胞摄取，强调了在解读此类数据时考虑血管滞留因素的重要性。
这项研究的意义深远。首先，它揭示了CD36这一已知在脂质代谢和动脉粥样硬化中扮演重要角色的受体，在sEVs介导的器官保护中具有全新功能，连接了不同领域的研究。其次，它为解决sEVs治疗应用中的核心瓶颈——即靶向递送和机制不清——提供了关键分子线索。理解CD36的作用，未来或许可以通过工程化改造sEVs膜成分来增强其靶向性，或通过调节CD36活性来优化疗效。最后，该研究证实了“非治疗性”细胞来源的sEVs也具有治疗价值，这可能为大规模、标准化生产治疗用sEVs开辟了更经济、更可控的细胞工厂选择。总而言之，这项工作不仅增进了我们对sEVs生物学行为的理解，也为开发基于sEVs的心肌梗死新疗法奠定了重要的理论基础。
