《The Plant Journal》：The SPL-family transcription factor MpSPL3 orchestrates the proper regulation of vegetative and reproductive programs in Marchantia polymorpha
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SPL（SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE）家族转录因子是植物发育的关键调控因子，但在苔类植物地钱中的功能尚不明确。本研究聚焦于该物种中非miRNA靶向的MpSPL3基因，通过基因敲除、敲低和过表达等分子遗传学手段，系统解析了其在地钱生活周期中的功能。研究发现，MpSPL3缺失导致营养体生长严重迟缓、芽胞杯数量减少，并完全丧失了配子托的形成能力。而过表达其长亚型MpSPL3.1则延迟并降低了配子托的产生效率。基因表达分析进一步揭示，MpSPL3功能的丧失影响了多个与营养发育和生殖细胞特化相关基因的表达。该研究首次证明了MpSPL3是协调地钱营养和生殖发育程序的核心调控因子，为理解植物SPL家族的进化与功能提供了新见解。本研究发表于《The Plant Journal》。
陆地植物的成功拓殖与多样化是生命史上里程碑式的事件。无论是配子体占优势的苔藓植物，还是孢子体占优势的维管植物，其生活史中都需要精确调控数个关键的发育阶段转换，其中从营养生长到生殖生长的转变尤为关键。SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE（SPL）转录因子家族是控制这一转换的核心调控因子之一，在高等植物中被广泛研究。然而，在代表早期陆地植物谱系的苔类植物中，SPL家族成员的功能在很大程度上仍是未知的。地钱（Marchantia polymorpha）作为一种新兴的模型苔类植物，其基因组仅编码四个SPL基因，其中MpSPL1和MpSPL2的功能已有初步探索，但另外两个非微小RNA（miRNA）靶向的成员——MpSPL3和MpSPL4的发育角色仍是空白。鉴于MpSPL3的表达谱与生殖转换过程相关联，深入研究其功能对于揭示SPL基因在植物进化早期的功能起源，以及理解苔类植物独特的发育调控网络具有重要意义。该研究论文发表于《The Plant Journal》。
为了探究MpSPL3的功能，研究团队综合运用了多种分子生物学与遗传学技术。主要包括：利用CRISPR/Cas9系统构建MpSPL3基因敲除（KO）突变体；设计人工miRNA（amiRNA）构建基因敲低（KD）突变体，以克服无法获得雌性敲除突变体的限制；通过构建过表达载体，分别在CaMV35S和MpEF1启动子驱动下过表达MpSPL3的两个转录本亚型（MpSPL3.1和MpSPL3.2）；利用农杆菌介导的孢子苗转化法将上述载体导入地钱。此外，研究还使用了启动子-报告基因（GUS）融合技术分析MpSPL3的表达模式；通过实时定量逆转录聚合酶链式反应（RT-qPCR）对目标基因的表达水平进行定量分析；并利用生物信息学工具对MpSPL3蛋白的特有结构域进行序列比对和亲水性分析。
MpSPL3产生两个具有不同表达模式的mRNA亚型
研究人员发现，MpSPL3基因通过可变剪接产生两个长度不同的mRNA亚型：MpSPL3.1（长亚型）和MpSPL3.2（短亚型），两者相差183个核苷酸，导致MpSPL3.1蛋白比MpSPL3.2多出一个61个氨基酸的片段。RT-qPCR分析表明，MpSPL3.1是优势表达亚型，且在配子托和孢子体中高表达。启动子活性分析显示，MpSPL3在营养叶状体、配子托的特定区域（如精子器托的托盘、颈卵器托的背部）以及生殖细胞（精原细胞、颈卵器）中均有活跃表达，提示其功能的广泛性。序列分析发现，这61个氨基酸的片段富含丝氨酸，且仅存在于苔类植物SPL3的同源蛋白中，可能具有谱系特异性功能。
Mpspl3ko雄性植株表现出异常的营养叶状体，产生少量芽胞杯，且不发育精子器托
通过CRISPR/Cas9获得了两个雄性Mpspl3敲除突变体系。突变体表现出严重的生长迟滞、叶状体分支紊乱、芽胞杯数量显著减少。最突出的表型是，即使在远红光诱导下，突变体也完全不能形成配子托（精子器托）。对突变体芽胞的详细观察发现，其形态发生严重异常，包括顶部分生组织缺刻缺失、形状改变、面积增大，且在萌发初期根毛（rhizoid）形成延迟。
Mpspl3kd植株表现出中度的叶状体形态缺陷，产生减少的芽胞杯，且不发育配子托
由于未能获得雌性敲除突变体，研究人员构建了针对MpSPL3的人工miRNA敲低株系。在雄性和雌性背景下的敲低植株中，均观察到了与敲除突变体方向一致但程度较轻的表型，包括叶状体变小、芽胞杯数量减少。同样，所有敲低株系在远红光下均不能形成配子托。这表明即使MpSPL3表达量部分降低，也足以完全抑制配子托的发育。
过表达MpSPL3.cds1而非MpSPL3.cds2影响配子托产生的时机和效率
组成型过表达MpSPL3的两个亚型产生了不同的效果。过表达短亚型MpSPL3.2没有引起明显的形态变化。而过表达长亚型MpSPL3.1则导致配子托（尤其是颈卵器托）的形成显著延迟，且数量减少。这表明MpSPL3.1蛋白水平的平衡对于精确调控生殖转换至关重要，其特有的61个氨基酸片段可能在此过程中发挥关键作用。
MpSPL3的缺失影响了地钱植株中负责正常营养和生殖发育的基因表达
为了从分子机制上解释观察到的表型，研究人员检测了Mpspl3ko突变体中一系列关键基因的表达变化。
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营养发育相关基因：多个对营养生长至关重要的基因，如MpANT（MpAINTEGUMENTA，参与分生组织维持）、MpROP（MpRHO OF PLANTS，参与细胞极性建立）、MpKAI2A（MpKARRIKIN INSENSITIVE2A，参与信号转导）和MpGLK（MpGOLDEN2-LIKE，参与叶绿体发育）的表达在突变体中均下调。这可能是突变体营养生长严重缺陷的分子基础。
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其他MpSPL基因及MpARF3：在白色光下，MpSPL1和MpSPL2（两个已知与生殖转换相关的SPL基因）以及MpSPL4的表达在敲除突变体中显著降低，而它们的推定抑制因子MpARF3的表达未变。在远红光下，MpSPL1和MpSPL2的下调程度减弱，表明远红光信号能部分补偿MpSPL3缺失对其表达的影响。这表明MpSPL3参与调控其他SPL家族成员的表达。
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生殖细胞特化关键基因：在生殖诱导条件下，多个控制生殖细胞命运的核心基因，包括MpBNB（MpBONOBO）、MpBZR3（MpBRASSINAZOLE-RESISTANT 3）、MpLRL（MpLOTUS JAPONICUS ROOTHAIRLESS LIKE）和MpCKI1（MpCYTOKININ-INDEPENDENT 1）的表达在Mpspl3ko突变体中均被强烈抑制。这直接解释了突变体完全丧失配子托形成能力的原因。
MpSPL3亚型1的过表达对MpBNB和MpBZR3基因表达的影响最为显著
有趣的是，在过表达MpSPL3.1的植株中，MpBNB和MpBZR3的表达也显著下调，尽管程度弱于敲除突变体。这为过表达植株配子托形成延迟和效率降低的表现提供了分子解释。
研究结论与讨论
本研究通过系统的功能分析，首次阐明了非miRNA靶向的SPL转录因子MpSPL3在地钱发育中的核心作用。综合基因敲除、敲低和过表达的结果，可以得出结论：MpSPL3是协调地钱营养生长与生殖转换的一个关键调控枢纽。其功能的缺失会导致从芽胞形态发生、叶状体生长、营养繁殖到有性生殖的全面且严重的发育缺陷。特别重要的是，MpSPL3对于配子托的形成是必需的，即使其表达量部分降低也会完全阻断这一过程。
研究表明，MpSPL3通过调控一个广泛的基因网络来行使功能。这包括：（1）影响MpANT、MpROP等控制分生组织活性和细胞极性的基因，从而维持正常的营养体结构；（2）在光照条件依赖下，调控其他SPL家族成员（MpSPL1, MpSPL2, MpSPL4）的表达，可能与它们协同工作；（3）直接或间接调控MpBNB、MpBZR3等生殖细胞特化的核心调控因子，从而掌控从营养阶段向生殖阶段转换的“开关”。
该研究还揭示了MpSPL3两个蛋白亚型的功能分化。仅有长亚型MpSPL3.1的过表达会影响生殖转换，而其特有的61个氨基酸片段是苔类植物SPL3蛋白中保守的，这暗示了该基因在苔类谱系中可能进化出了特有的调控模块。
总之，这项工作将MpSPL3确立为地钱生命周期多个发育程序的重要协调者。与miRNA靶向的、功能相对特化的MpSPL1和MpSPL2不同，MpSPL3展现出更基础、更广泛的调控特性。这些发现不仅增进了我们对苔类植物发育生物学的理解，也为探讨SPL转录因子家族在陆地植物进化过程中的功能分化与保守性提供了宝贵线索。
