激酶KEY1通过调控相分离维持藻类碳浓缩细胞器“蛋白凝聚体”大小与功能

《Nature Cell Biology》：Kinase KEY1 controls pyrenoid condensate size throughout the cell cycle by disrupting phase separation interactions

本期《Nature Cell Biology》推荐研究：生物分子凝聚体（Biomolecular condensates）如何调控其大小、数量和相变动态是细胞生物学的重要前沿问题。研究人员以单细胞藻类（Chlamydomonas reinhardtii）中负责全球三分之一CO2固定的蛋白凝聚体——蛋白核（pyrenoid）为模型，鉴定到一个关键激酶KEY1。KEY1通过磷酸化连接蛋白EPYC1，动态调控Rubisco-EPYC1相分离相互作用，从而在细胞周期中精准控制蛋白核凝聚体的大小、数量和溶解/重凝过程。这项工作揭示了活细胞内调控生物分子凝聚体相行为的一种核心分子机制，为理解相关细胞器功能及其工程化改造提供了新思路。

　　

想象一下，细胞内部并非均匀的“汤”，而是分布着许多功能各异的、动态的、液滴状的“微型工厂”，它们被称为生物分子凝聚体（Biomolecular condensates）。这些无膜细胞器通过液-液相分离（Liquid-liquid phase separation, LLPS）形成，能够将特定生物分子富集在一起，从而高效执行从核糖体合成到代谢调控等多种关键功能。然而，一个核心的生物学谜题始终悬而未决：细胞是如何主动、精准地调控这些“液滴”的大小、数量、位置以及何时溶解、何时重新形成的？这种调控对于维持其正常功能至关重要，例如，酶促反应凝聚体的大小直接影响其催化效率，而凝聚体大小或数量的异常也与多种疾病相关。

在众多的生物分子凝聚体中，有一个显得尤为特殊和重要，那就是存在于真核藻类叶绿体中的蛋白核（pyrenoid）。这个独特的凝聚体负责浓缩二氧化碳（CO₂），并将其固定在核心酶Rubisco周围，从而驱动了地球上约三分之一的初级生产力。在模式生物莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）中，蛋白核由Rubisco酶和一种本质无序的连接蛋白EPYC1通过多价相互作用发生相分离而形成。有趣的是，在细胞分裂过程中，母细胞中单一的、大的蛋白核凝聚体会快速溶解，随后在子细胞中重新形成多个小的凝聚体，并最终“成熟”为每细胞一个的大凝聚体。这种高度动态的相行为提示存在精密的调控机制，但其背后的分子“开关”一直未被发现。理解蛋白核的调控不仅有助于揭示生物分子凝聚体的普适性调控原理，也对未来将这种高效的碳浓缩机制引入作物、以提升光合作用效率的合成生物学目标具有重大意义。

为了回答上述问题，He等人开展了一项系统性研究。这项发表于《Nature Cell Biology》的工作，综合运用了遗传学、细胞生物学、体外重构和数学建模等多种手段，旨在揭示调控蛋白核凝聚体大小和动态的核心机制。

研究主要运用了以下几类关键技术方法：利用CLiP突变体库筛选和构建基因敲除（key1）与回补株系，进行遗传表型分析；通过免疫共沉淀结合质谱分析鉴定蛋白相互作用；采用活细胞延时成像（共聚焦显微镜）和透射电镜观察蛋白核在细胞周期中的动态变化；利用Phos-tag凝胶电泳和磷酸化蛋白质组学分析EPYC1的磷酸化状态及位点；进行体外蛋白纯化，开展激酶活性测定、相图测定和荧光关联光谱分析，验证KEY1对EPYC1的直接磷酸化作用及其对相分离的影响；最后，结合表面等离子共振和定点突变，确定了KEY1定位所依赖的Rubisco结合基序，并构建了基于Flory-Huggins理论的连续相数学模型，模拟和解释了观测到的凝聚体动态行为。

研究结果

1. 候选蛋白激酶KEY1与EPYC1发生物理相互作用

基于蛋白核在细胞分裂中快速溶解的动态与翻译后修饰调控的时间尺度相符，以及之前研究中发现EPYC1存在磷酸化修饰，研究人员假设其磷酸化可能调控蛋白核的相行为。通过筛选，他们将目标锁定在一个预测的双特异性蛋白激酶Cre01.g008550上，并根据后续结果将其命名为KEY1（kinase of EPYC1）。免疫共沉淀-质谱分析证实了KEY1与EPYC1之间存在直接的物理相互作用。

2. KEY1是维持正常蛋白核大小、数量和功能所必需的

研究人员获得了两个key1插入突变体等位基因（key1-1和key1-2）。与野生型细胞通常只有一个大的蛋白核不同，透射电镜和活细胞成像显示，key1-1突变体在整个细胞周期中都存在多个分散的、较小的蛋白核凝聚体。将野生型KEY1基因回补到突变体中，可以恢复单一、大蛋白核的表型，证明该表型确实由KEY1基因功能缺失导致。功能上，key1突变体在低CO₂条件下（此时需要功能完整的蛋白核进行碳浓缩）表现出生长缺陷，而在高CO₂或黑暗中（不依赖蛋白核）则生长正常，表明KEY1对蛋白核的正常功能至关重要。

3. KEY1是蛋白核在细胞分裂过程中发生尺寸、数量及溶解动态变化所必需的

通过对同步化细胞的延时观察，研究人员详细刻画了野生型细胞中蛋白核的动态：在细胞分裂时，母细胞的单一蛋白核会先溶解，随后出现多个小凝聚体，并最终“成熟”为子细胞中的单一凝聚体。然而，在key1-1突变体中，这一系列动态过程完全缺失。突变体的多个小凝聚体在细胞分裂过程中既不溶解，其大小和数量也几乎没有变化，表明KEY1是驱动蛋白核在细胞分裂时发生溶解和重塑的关键因子。

4. KEY1抑制细胞生长过程中异位凝聚体的出现

进一步观察发现，key1-1突变体中额外的蛋白核凝聚体是在光照生长阶段逐渐出现的。这表明在野生型细胞中，KEY1的持续活性能够抑制小凝聚体（异位成核）的形成或在其变得可见前将其溶解，从而维持单一凝聚体的状态。

5. KEY1是EPYC1发生磷酸化所必需的

生化分析显示，与野生型相比，key1突变体细胞中的EPYC1在Phos-tag凝胶电泳（可区分磷酸化状态）中迁移更快，表明其磷酸化程度降低。磷酸酶处理证实了这种迁移差异源于磷酸化。将KEY1回补到突变体中可恢复EPYC1的磷酸化状态。更重要的是，构建一个所有丝氨酸/苏氨酸均被突变为丙氨酸的、不可被磷酸化的EPYC1突变体（EPYC1^phosphonull），即使在野生型KEY1存在的情况下，也会导致多蛋白核表型。这直接证明KEY1通过磷酸化EPYC1来调控蛋白核的相行为。

6. KEY1直接磷酸化EPYC1的特定位点

体外实验证实，纯化的KEY1能够直接磷酸化纯化的EPYC1。磷酸化蛋白质组学分析发现，在体内和体外，EPYC1的多个磷酸化位点都位于或紧邻其与Rubisco的结合区域。这表明磷酸化可能直接影响EPYC1与Rubisco的相互作用。

7. EPYC1的磷酸化程度呈现昼夜节律性变化

在昼夜节律生长条件下，EPYC1的磷酸化水平呈现动态变化：在夜间及清晨最低，白天升高，并在细胞分裂开始前的傍晚达到峰值。这种变化与之前报道的KEY1mRNA表达峰值的时间相吻合，暗示KEY1的活性或表达量变化驱动了磷酸化水平的波动，从而对应了白天抑制异位成核和傍晚驱动分裂期溶解的不同需求。

8. KEY1磷酸化的EPYC1在体外促进Rubisco-EPYC1凝聚体的溶解

体外相图测定实验表明，经KEY1磷酸化后的EPYC1完全丧失了与Rubisco形成相分离凝聚体的能力。荧光关联光谱分析进一步揭示，磷酸化直接破坏了EPYC1与Rubisco在稀相中的结合。在体内，通过细胞裂解和离心分离凝聚体相与稀相，发现磷酸化的EPYC1主要富集在稀相，而未磷酸化的EPYC1则富集在凝聚体相。

9. KEY1通过一个Rubisco结合基序定位于蛋白核凝聚体并发挥功能

免疫荧光显示，KEY1持续定位于蛋白核凝聚体。序列分析发现KEY1含有一个预测的Rubisco结合基序（Rubisco-binding motif, RBM）。表面等离子共振实验证实含有该基序的肽段能够结合Rubisco。当突变KEY1的RBM后，KEY1无法定位到蛋白核，其恢复EPYC1磷酸化和纠正多蛋白核表型的能力也显著下降，但其激酶活性本身并未受损。这表明KEY1的正确定位（富集于凝聚体内部）对其有效磷酸化底物EPYC1至关重要。

10. 数学模型支持KEY1调控蛋白核尺寸、数量及定位的机制

基于上述发现，研究人员建立了一个简约的数学模型。该模型将EPYC1分为“粘性”（未磷酸化）和“非粘性”（磷酸化）两种状态，并引入由KEY1（激酶）和假设的磷酸酶（phosphatase）催化的双向转换。模拟结果显示：

• •
  通过调控激酶活性水平，该模型能够复现细胞分裂过程中观察到的单一凝聚体→溶解→多小凝聚体→再成熟为单一凝聚体的完整动态。
• •
  在特定参数下，系统能够实现凝聚体的尺寸控制，即不同初始大小的凝聚体会收敛到一个稳定的大小。
• •
  模型还预测，该系统能使凝聚体自动定位于空间中心（如叶绿体中心），并使得多个凝聚体之间表现出相互排斥的倾向，这可能解释了体内观察到的凝聚体均匀分布现象。
• •
  模拟还表明，完全的KEY1缺失（对应EPYC1“过度粘性”）会抑制凝聚体的熟化（Ostwald ripening），导致多个小凝聚体长期共存；而低水平的KEY1活性则有助于溶解异位形成的小凝聚体。

结论与讨论

本研究通过多学科交叉的方法，在莱茵衣藻中鉴定并阐明了一个调控生物分子凝聚体相行为的核心激酶KEY1。研究得出结论：KEY1通过其Rubisco结合基序持续定位于蛋白核凝聚体内部，并通过磷酸化连接蛋白EPYC1上位于Rubisco结合区域的位点，直接削弱EPYC1与Rubisco之间的相互作用。这一方面促使磷酸化的EPYC1从凝聚体相流向稀相，另一方面也抑制了新的凝聚体成核。通过调节KEY1的活性水平，细胞能够在生长阶段抑制异位凝聚体形成以维持单一、高效的碳浓缩工厂，并在细胞分裂时大幅提高活性以驱动凝聚体溶解，确保其正确分配到子细胞中。研究所构建的数学模型不仅为观察到的复杂动力学行为提供了合理解释，还揭示了这种基于激酶-磷酸酶循环的“活性”相分离系统所具有的尺寸控制、自动定位和凝聚体间排斥等 emergent properties（涌现特性）。

这项工作的意义重大。首先，它首次在活体细胞内发现并证实了一种通过激酶介导的翻译后修饰来主动、动态调控生物分子凝聚体大小、数量和溶解的分子机制，将此前多停留在理论阶段的“活性相分离”模型落到了具体的分子实体上。其次，研究以具有明确生理功能的蛋白核为模型，将相分离的调控与其关键的生物学功能（碳固定效率）直接联系起来，为理解其他功能性凝聚体（如核仁、应激颗粒等）的调控与功能关联树立了范例。最后，该研究阐明的KEY1-EPYC1调控轴，为未来在作物中人工构建或优化类似CO₂浓缩机制提供了关键的调控靶点和理论框架，显示出在合成生物学和农业增产方面的潜在应用价值。总之，这项工作不仅深化了对生物分子凝聚体这一基本细胞组织原理的认识，也为相关的基础生物学研究和应用探索开辟了新的道路。