《Cancer Immunology, Immunotherapy》：Human CD3 complex is required for the generation of T-cell receptor-like chimeric antigen receptor targeting WT1 in natural killer cells
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推荐：为解决CAR-NK细胞疗法因缺乏可靶向的表面肿瘤抗原而应用受限的问题，研究者探索了靶向细胞内肿瘤抗原的新策略。他们以WT1肿瘤抗原为靶点，设计了T细胞受体样嵌合抗原受体(TCR-like CAR)，并将其导入NK-92细胞。研究揭示，该TCR-like CAR-WT1在NK细胞表面的成功表达需要人CD3复合体的辅助，这一策略最终构建出能有效杀伤WT1+/HLA-A2+肿瘤细胞的功能性CAR-NK细胞，为将细胞内抗原纳入CAR免疫疗法靶点库提供了新思路。
在癌症治疗领域，以嵌合抗原受体(CAR)武装的T细胞(CAR-T)疗法已在部分血液肿瘤中展现出革命性疗效，但其广泛应用仍面临两大瓶颈。首先，CAR-T产品属于自体疗法，生产过程繁琐、成本高昂，且存在制造失败风险。其次，传统CAR只能识别肿瘤细胞表面的蛋白靶点，而许多极具潜力的肿瘤抗原（如WT1）却隐藏在细胞内部。幸运的是，自然杀伤(NK)细胞作为“现成”的通用免疫细胞来源，其CAR武装版本（CAR-NK）展现出良好的安全性和规模化生产前景。为了将CAR疗法的靶点从“表面”拓展到“内部”，科学家们将目光投向了能识别“肽-主要组织相容性复合体I类分子(pMHC-I)”复合物的T细胞受体样CAR(TCR-like CAR)。然而，这种新型CAR能否成功武装NK细胞，并在其表面稳定表达和发挥作用，仍是一个未知的悬案。
一项发表于《Cancer Immunology, Immunotherapy》的研究，正是为了破解这一难题。研究人员选择了被美国国家癌症研究所评为最具吸引力的肿瘤抗原——WT1（Wilms' tumor 1），设计了一款针对HLA-A*02:01呈递的WT1(126-134)肽段的三代TCR-like CAR（称为CAR-WT1）。他们的研究意外发现，将这个CAR直接导入FDA批准的临床级NK细胞系NK-92中，它竟然“躲”在细胞内部，无法跑到表面“站岗放哨”。这就像给士兵配了一把先进的狙击枪，但枪却被锁在了仓库里，无法使用。进一步的探索揭示，让这把“狙击枪”成功上线的关键，竟然是借用了T细胞的“装配工具”——人CD3复合体。通过一个巧妙的“两步走”策略，先给NK-92细胞“安装”CD3复合体，再导入CAR-WT1，最终成功构建出表面稳定表达CAR-WT1的NK细胞（CAR-WT1/CD3 NK-92细胞）。这支“重装部队”展现出了对表达WT1和HLA-A2的肿瘤细胞强大而特异的杀伤力，并且不伤及正常细胞。更有趣的是，一旦CAR-WT1成功“上岗”，其表面的CD3“脚手架”似乎就不再是执行杀伤任务所必需的了。这项研究不仅证明了利用CD3复合体辅助表达TCR-like CAR在NK细胞中的可行性，还为CAR-NK疗法开辟了一条靶向细胞内肿瘤抗原的全新大道。
为开展此项研究，作者运用了几个关键的技术方法。研究中使用了包括Jeko-1、THP-1、K562、HL60在内的多种血液肿瘤细胞系作为靶细胞，并利用Western blot和流式细胞术分别验证了其细胞内WT1蛋白和表面HLA-A2的表达，以定义靶细胞类型（WT1+/HLA-A2+或WT1+/HLA-A2–）。通过分子克隆构建了靶向WT1(126-134)/HLA-A2的三代CAR-WT1慢病毒载体，以及包含CD3ζ, CD3ε, CD3δ, CD3γ亚基的人CD3复合体逆转录病毒载体。采用分步转导策略：先将CD3复合体导入NK-92细胞，建立CD3 NK-92细胞；再用CAR-WT1慢病毒转导这些细胞，并通过流式细胞分选(FACS)富集表面CAR阳性的细胞，最终获得稳定的CAR-WT1/CD3 NK-92细胞。通过流式细胞术系统检测了CAR在细胞表面和胞内的表达、CD3表达以及NK细胞活化标记物（如CD107a）。细胞毒性功能通过基于Annexin V/7-AAD染色的流式细胞术和荧光素酶报告基因法进行定量评估。此外，还采用了实时定量PCR(qPCR)分析基因表达变化，并利用DAVID数据库进行KEGG通路分析和SIGNOR数据库进行信号网络分析，以探究CAR-WT1/CD3 NK-92细胞的分子特征。
研究结果
Construction of TCR-like CAR-WT1 and validation of WT1 and HLA-A2 expression in target tumor cells
研究人员成功构建了第三代CAR-WT1，其单链可变区片段(scFv)靶向HLA-A*02:01呈递的WT1(126-134)肽段。他们在多种血液肿瘤细胞系中验证了WT1蛋白的高表达，并通过流式细胞术确认了THP-1和Jeko-1细胞表达HLA-A2，从而将靶细胞分为CAR可靶向的WT1+/HLA-A2+组（Jeko-1, THP-1）和对照的WT1+/HLA-A2–组（K562, HL60）。
CAR-WT1 T cells exhibit improved cytotoxicity against hematologic cancer cells
在原发性T细胞中，CAR-WT1能够正常表达于细胞表面，并展现出对WT1+/HLA-A2+靶细胞（Jeko-1, THP-1）增强的特异性杀伤作用，初步验证了CAR-WT1构建体的功能有效性。
CAR-WT1 transgene alone cannot be expressed on the NK cell surface
然而，当将相同的CAR-WT1构建体导入NK-92细胞时，尽管基因组整合和mRNA转录均成功，CAR蛋白却无法在细胞表面检测到，仅存在于胞内，因而将这些细胞命名为胞内(ic)-CAR-WT1 NK-92细胞。这表明该TCR-like CAR在NK细胞环境中独自无法完成正确的膜定位。
Two-step generation of NK-92 cells with surface CAR-WT1
受此前关于完整T细胞受体(TCR)在NK细胞中表达需要CD3复合体辅助的报道启发，研究者设计了两步法策略。首先，将人CD3复合体（CD3ζ, ε, δ, γ亚基）导入NK-92细胞，建立CD3 NK-92细胞。然后，再用CAR-WT1转导这些细胞。结果成功获得了表面稳定表达CAR-WT1的NK细胞，命名为CAR-WT1/CD3 NK-92细胞，证实了人CD3复合体是TCR-like CAR-WT1在NK细胞表面表达的必要条件。
CAR-WT1/CD3 NK-92 cells show dose- and time-dependent cytotoxicity against target tumor cells
功能实验表明，CAR-WT1/CD3 NK-92细胞能有效杀伤WT1+/HLA-A2+的靶肿瘤细胞（Jeko-1, THP-1），且具有剂量和时间依赖性，而对WT1+/HLA-A2–的细胞（K562）或正常外周血单个核细胞(PBMCs)没有显著杀伤，证明了其杀伤的特异性。结合分析进一步显示，CAR-WT1/CD3 NK-92细胞与靶细胞的结合能力更强。
Activation of NK cell function and signaling by CAR-WT1/CD3 transgene
在与靶细胞共孵育后，CAR-WT1/CD3 NK-92细胞表现出更高的脱颗粒标记CD107a表达以及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)分泌。基因表达谱和通路分析显示，相较于未转导的NK-92细胞，CAR-WT1/CD3 NK-92细胞中与免疫激活相关的基因（如干扰素和肿瘤坏死因子相关基因）显著上调，KEGG富集分析提示Toll样受体信号通路、NK细胞介导的细胞毒性和JAK-STAT信号通路等被激活，表明这些细胞处于一种“预激活”的强化状态。
NK-92 cells expressing surface CAR-WT1 with or without surface CD3 exhibit similar cytotoxicity against target tumor cells
在成功表达表面CAR-WT1的细胞群体中，部分细胞同时表达表面CD3，部分则不表达。研究人员将细胞按表面CD3表达情况分选后比较发现，无论表面是否有CD3，只要CAR-WT1成功表达，这些NK细胞亚群对靶细胞的杀伤效力以及CD107a活化水平均无显著差异。这表明，CD3复合体的作用在于辅助CAR-WT1完成表面转运和定位，一旦CAR成功“安家”，其执行杀伤功能时不再依赖于表面CD3的存在。
结论与讨论
本研究的核心结论是：成功开发了一种利用人CD3复合体辅助表达的策略，能够在NK-92细胞表面实现功能性TCR-like CAR（靶向WT1）的稳定表达，从而构建出能特异性杀伤WT1+/HLA-A2+肿瘤细胞的CAR-NK细胞。这一发现具有双重重要意义。
首先，在应用层面上，它突破了传统CAR-NK疗法只能靶向细胞表面抗原的限制，将强大的细胞内肿瘤抗原WT1纳入了靶点库，显著拓宽了CAR-NK细胞治疗的适应症范围。使用已获FDA批准用于临床试验的NK-92细胞系作为平台，也增强了其转化为“现货型”通用细胞产品的潜力。
其次，在科学机制上，本研究揭示了一个有趣的现象：即便使用基于scFv和CD28跨膜区的传统CAR结构，当其中的抗原结合域是TCR-like scFv时，其在NK细胞中的表面表达可能仍然依赖于T细胞特有的CD3复合体环境。这提示了TCR-like CAR在细胞生物学行为上可能与完整TCR有相似之处，其正确的折叠、组装或膜定位需要额外的辅助因子。研究观察到CAR-WT1在缺乏CD3的NK细胞中形成胞内聚集，暗示CD3可能起到了“分子伴侣”的作用，协助其正确折叠以防止滞留。
最终，研究者建立的“CD3-NK-92细胞”平台，为其他可能面临表面表达难题的TCR-like CAR甚至某些常规CAR的构建提供了通用解决方案。这项研究不仅为基于WT1的免疫治疗增添了新的武器，更开辟了一条将细胞内癌蛋白通过pMHC-I途径纳入CAR-NK疗法靶标体系的通用技术路径，对未来癌症免疫治疗的发展具有重要的启示意义。当然，此策略是否普适于其他TCR-like CAR，以及其中的详细分子机制，仍有待后续研究的进一步验证和探索。
