热响应性羟基丁基壳聚糖水凝胶在颞下颌关节骨关节炎中的氧化应激调节及软骨再生应用

《Sustainable Materials and Technologies》：Thermo-responsive Hydroxybutyl-chitosan hydrogel for oxidative stress modulation and cartilage regeneration in temporomandibular joint osteoarthritis

颞下颌关节骨关节炎（TMJ-OA）是一种由氧化应激、软骨流失和炎症引发的退行性疾病，现有治疗手段难以恢复关节结构和功能。本研究开发了一种具有热响应特性的羟丁基壳聚糖水凝胶（HBC@ZIrK），整合铱纳米酶（Ir NPs）、八面体咪唑酯框架-8（ZIF-8）和软骨生成素（KGN），通过Ir NPs清除氧化应激产物、ZIF-8稳定Ir NPs并缓释KGN，实现抗炎与软骨再生协同作用。水凝胶在体温下凝胶化形成局部缓释库，维持Ir NPs和KGN的持续释放，动物实验证实其可显著改善关节形态并抑制炎症因子。

　　

作者：王彦恩、王佩、蔡琪、张新媛、郭佳轩、王世革、唐震、陈铁楼

单位：海军医科大学第一附属医院口腔科，中国上海200433

摘要

颞下颌关节骨关节炎（TMJ-OA）是一种以氧化应激、软骨丢失和炎症为特征的退行性疾病。目前的疗法主要具有缓解症状的作用，无法恢复关节的结构或功能。本文开发了一种可注射的多功能羟基丁基壳聚糖水凝胶（HBC@ZIrK），该水凝胶具有热响应性的溶胶-凝胶转变特性，结合了铱纳米酶（Ir NPs）、沸石咪唑框架-8（ZIF-8）和软骨生成分子kartogenin（KGN），以实现协同治疗。ZIF-8稳定了超小尺寸的Ir NPs，保持了它们的多酶活性，并在炎症微环境中实现了KGN的有效负载和持续释放。羟基丁基壳聚糖基质确保了该水凝胶在室温下呈溶液状态可注射，并在体温下迅速凝胶化，形成局部储库，从而实现治疗成分在关节内的长期保留。体外研究表明，HBC@ZIrK具有良好的细胞相容性、强大的活性氧清除能力、凋亡抑制作用以及持续的KGN释放效果。在大鼠TMJ-OA模型中，微CT和组织学分析证实HBC@ZIrK水凝胶能够保护软骨下骨、减少骨赘、抑制炎症细胞因子并促进软骨基质的合成。值得注意的是，HBC@ZIrK组的关节形态与健康对照组无统计学差异，这突显了KGN和纳米酶介导的抗氧化作用之间的协同效应。总体而言，这些结果表明HBC@ZIrK是一种微创且有效的治疗平台，为TMJ-OA提供了微观环境调节和结构再生的双重作用机制。

引言

颞下颌关节骨关节炎（TMJ-OA）是一种多因素引起的退行性疾病，其病因和发病机制涉及机械负荷过重、慢性炎症、细胞外基质降解以及软骨细胞代谢异常之间的复杂相互作用[1]、[2]。早期和中期阶段的治疗主要依赖非甾体抗炎药（NSAIDs）来缓解疼痛，而晚期病例通常需要开放性手术干预[3]。然而，这些方法的效果有限[4]、[5]、[6]。NSAIDs虽然可以缓解疼痛，但不能阻止疾病进展，且长期或高剂量使用可能会产生不良反应[7]。尽管开放性手术能够矫正严重的关节畸形，但存在感染、恢复时间长和潜在并发症等风险[8]。因此，迫切需要新型、有效且微创的治疗策略来恢复关节功能并阻止TMJ-OA的进展。

水凝胶作为TMJ-OA的治疗平台具有显著优势，能够解决该疾病的临床和病理挑战。它们的可注射性和原位凝胶化特性（例如热敏或pH响应性转变）使得微创给药成为可能[9]、[10]。此外，水凝胶的三维多孔网络可作为持续释放的储库：物理上捕获治疗剂，并在数天到数周内逐渐、可控地释放药物，这与TMJ-OA的缓慢进展过程相匹配[11]、[12]。另一个显著优势是它们优异的生物相容性和可调的生物降解性，可以减少在敏感的TMJ微环境中的免疫反应和炎症反应[13]、[14]。此外，水凝胶基质可以模拟细胞外基质的特性，为受损关节提供机械支持，减少关节表面之间的摩擦，并创造有利于软骨细胞存活和增殖的微环境[15]、[16]。

越来越多的证据表明，活性氧（ROS）的过度产生在TMJ-OA的发病机制中起核心作用，通过诱导软骨细胞凋亡、加速关节基质降解和放大炎症反应来促进疾病进展[17]、[18]、[19]。纳米酶是一种具有酶模拟活性的纳米材料，可以减轻氧化应激、保护软骨并显著延缓TMJ-OA的进展[20]、[21]、[22]、[23]。其中，铱纳米颗粒（Ir NPs）具有出色的ROS清除效率和组合治疗的适用性[24]、[25]。然而，Ir NPs在生理介质中容易聚集，这会降低它们的催化表面积、削弱酶样活性并缩短体内滞留时间[26]。值得注意的是，即使具有有效的ROS清除能力，基于纳米酶的单一疗法也无法实现关节功能的完全恢复，而软骨退化这一TMJ-OA的核心病理特征仍然未得到解决[27]、[28]、[29]。Kartogenin（KGN）是一种强效的小分子，可以通过诱导间充质干细胞（MSC）分化为软骨细胞、促进软骨特异性基质成分（如II型胶原蛋白、聚集蛋白聚糖）的合成以及通过抑制分解代谢途径和软骨细胞凋亡来保护软骨[30]。然而，KGN的应用受到其水溶性差、生物利用度低和从关节腔中快速清除的限制，这些因素阻碍了其在关节内的持续治疗浓度和给药

在这项研究中，我们设计了一种多功能可注射水凝胶系统——羟基丁基壳聚糖@ZIF-8@Ir/KGN（HBC@ZIrK），用于协同治疗TMJ-OA（图1）。为同时解决Ir NPs的稳定性和KGN的释放问题，选择了具有高孔隙率和大表面积的沸石咪唑框架-8（ZIF-8）作为多功能纳米载体，以共同封装Ir纳米酶和KGN，防止Ir聚集并释放KGN[33]、[34]。HBC水凝胶在体温下迅速发生溶胶-凝胶转变，在原位形成持续释放的储库[35]。在该水凝胶平台上，Ir NPs清除ROS并减轻炎症，为KGN发挥其软骨生成和软骨再生作用创造有利环境。同时，KGN修复软骨基质并增强Ir NPs的细胞保护效果。其疗效在体外实验和TMJ-OA大鼠模型中得到了系统评估，旨在提供一种新型且有效的微创治疗平台。

材料

三氯化铱（IrCl₃·3H₂O，99.9%（痕量金属含量），聚乙烯吡咯烷酮（PVP K30），乙醇，六水合硝酸锌（Zn(NO₃)₂·6H₂O），2-甲基咪唑，壳聚糖和甲醇购自Aladdin Reagent Co.（上海，中国）。1,2-丁烯氧化物，氢氧化钠（NaOH）和异丙醇购自Macklin Biochemical Co., Ltd.（上海，中国）。KGN购自MedChemExpress（MCE，美国新泽西州蒙茅斯 junction）。Dulbecco's Modified Eagle's Medium（DMEM）

Ir-PVP、ZIF-8和ZIF-8@Ir/KGN纳米颗粒的合成与表征

在本研究中，通过使用PVP作为稳定剂，采用一锅法成功制备了Ir-PVP纳米颗粒。反应混合物的颜色逐渐从浅黄色变为深棕色（图S1），这与先前的报道一致，表明Ir-PVP的形成[39]、[40]。溶液的可见-紫外光谱变化进一步证实了Ir-PVP纳米颗粒的成功合成（图1a）。通过TEM观察了Ir-PVP纳米颗粒的形态和大小（图1b）。

结论

我们开发了一种具有热响应性溶胶-凝胶转变特性的多功能可注射水凝胶（HBC@ZIrK），通过同时应对氧化应激和软骨退化，为TMJ-OA提供了全面的治疗方案。这一合理设计的平台将Ir纳米酶和KGN共同封装在ZIF-8纳米载体中，并置于HBC水凝胶中，利用室温下的溶液状态进行微创关节内注射，并在体温下凝胶化

作者贡献声明

王彦恩：撰写初稿，项目管理，方法学设计，数据整理，概念构思。王佩：撰写初稿，项目管理，方法学设计，数据整理，概念构思。蔡琪：撰写初稿，项目管理，方法学设计，数据整理，概念构思。张新媛：数据验证，软件操作，数据整理。郭佳轩：数据验证，软件操作。王世革：项目协调

出版同意

所有作者均已审阅并同意发表本手稿。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了2023年基础医学研究项目（编号：2023PY09）的支持，以及海军医科大学第一附属医院的上海科学技术重大项目（编号：2023SHZDZX02-030702）和上海第四人民医院学科促进计划项目（编号：SY-XKZT-2025-1016）的支持。

我们还要感谢陈吉槐博士在动物实验中的支持。