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聚azulene（PAz）电化学与化学合成方法及其细胞相容性研究。通过FTIR、Raman、UV-Vis等分析PAz物理化学特性，发现电化学合成PAz薄膜导电性优于化学合成。采用NIH/3T3、HaCaT和ES R1细胞进行生物测试，证实PAz短期细胞相容性良好，但合成方法影响材料结构及细胞响应差异。
莱奥娜·马赫洛娃（Leona Mahelová）、米罗斯拉瓦·特尔霍娃（Miroslava Trchová）、索尼娅·科托维茨（Sonia Kotowicz）、大卫·斯科达（David ?koda）、卡罗利娜·科库尔科娃（Karolína Kocourková）、兹登卡·维霍娃（Zdenka Víchová）、扬·维哈（Jan Vícha）、维拉·卡什帕尔科娃（Věra Ka?párková）、彼得·亨波利切克（Petr Humpolí?ek）
聚合物系统中心，托马斯·巴塔大学（Tomas Bata University），兹林市，托马斯·巴塔街5678号，760 01兹林，捷克共和国
摘要
聚偶氮烯（Polyazulene）是一种被低估的导电聚合物，其独特结构包含一个具有固有偶极矩的融合环结构。该材料主要在有机电子学领域（如光伏电池）的研究中得到关注。然而，迄今为止尚未有关于聚偶氮烯生物特性的报道。本研究是首次对此进行探讨，不仅描述了电化学和化学合成的聚偶氮烯及其所谓“真正聚偶氮烯”的性质，还对其细胞相容性进行了评估。通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）、拉曼光谱（Raman）、紫外-可见光谱（UV-Vis）、轮廓测量（profilometry）、扫描电子显微镜（scanning electron microscopy）、伏安法（voltammetry）、范德保威导电率测量（van der Pauw conductivity measurement）和热重分析（thermogravimetric analysis）等技术，研究了聚偶氮烯粉末和薄膜的物理化学性质。细胞相容性测试使用了NIH/3T3小鼠胚胎成纤维细胞、HaCaT人类角质形成细胞以及ES R1小鼠胚胎干细胞。研究结果表明，所测试的聚偶氮烯在体外（in vitro）环境中表现出总体良好的细胞相容性，但具体效果受合成方法和条件的影响。在优化沉积条件下，电化学合成的聚偶氮烯能形成具有中等导电性的连续薄膜；而化学制备的薄膜则不均匀，难以进行可靠的导电率测量。因此，这些导电性的差异主要反映了薄膜形态和沉积条件的不同，而非聚偶氮烯本身的电子性质。
引言
聚合物在医学和生物研究中的成功应用，尤其是在组织工程领域，依赖于对其与细胞相互作用的理解。这些材料-细胞相互作用受到材料性质的显著影响，而导电性为材料带来了明显优势。导电支架能够模拟组织的天然导电性，促进细胞间的交流，从而改善电敏感组织（如心脏或神经组织）的整合性和功能性。此外，导电聚合物还为可控的电刺激提供了平台，引导细胞行为，促进生长和迁移，加速神经再生，并有助于心肌生成[1]、[2]、[3]、[4]。
导电聚合物因其电子传导和离子传导能力的独特组合、低密度以及易于加工的特性而受到广泛关注，这些是金属所不具备的。导电聚合物的特点在于其共轭π键和掺杂离子，使其能够根据环境条件在不同氧化还原状态之间转换。由于这种多功能性，大多数导电聚合物（如聚吡咯和聚苯胺）已在包括生物医学在内的多个领域得到深入研究与应用。相比之下，聚偶氮烯（PAz）至今仍受到的关注较少。
用于聚偶氮烯合成的单体是偶氮烯（Az），即图1所示的双环[5.3.0]十烯。偶氮烯是一种芳香烃，属于萘的异构体，含有5元和7元缩合环结构。它具有特征性的深蓝色，并具有特定的物理化学性质，因此其衍生物被广泛应用于光电器件[5]、[6]、太阳能电池[7]和传感器[9]中。关于偶氮烯及其衍生物的生物性质，已研究其光毒性[10]、[11]、抗炎活性[12]、抗糖尿病活性[13]以及抗肿瘤活性[14]等。
在开始任何偶氮烯聚合反应之前，需要考虑三个关键因素，因为它们可能对聚合过程产生重大影响：首先，偶氮烯中的电子共振离域会在1、3、5、7位置产生富电子结构，这些位置容易与亲电试剂反应；而2、4、6、8位置的电子较为贫乏，更容易与亲核试剂反应[17]、[18]。此外，7元环带有部分正电荷，5元环带有部分负电荷，导致其偶极矩约为1.08 D[19]。最后，偶氮烯可被氧化为偶氮烯鎓碳正离子（azulenylium carbocation），这种形式比偶氮烯本身稳定约10 kJ/mol[17]，并且具有强烈的电子给体特性[17]。
最常见的偶氮烯合成方法是电化学聚合，通常在四丁基铵六氟磷酸盐[20]、[21]、[22]或四丁基铵高氯酸盐[24]电解质溶液中（溶剂为乙腈[20]、[21]、[22]或脱氧蒸馏的苯腈[23]）进行，最终得到聚偶氮烯（PAz，见图1）。此外，也可以通过溴化或碘化偶氮烯衍生物的化学聚合来制备PAz[21]、[25]、[26]、[27]、[28]。Gr?dzka等人（2018年）报道了一种独特的合成方法：将偶氮烯与氧化剂三氯化铁在多种溶剂（水、乙醇、乙腈、二氯甲烷、碳酸丙烯酯和二甲甲酰胺）中反应，得到黑色粉末或液态的PAz产物[29]。
Kihara等人（1997年）的研究指出，传统的聚偶氮烯应正确称为聚偶氮烯ylene或脱氢聚偶氮烯（dehydropolyazulene），并展示了一种通过阳离子聚合制备“真正聚偶氮烯”（truePAz）的方法（见图2）。该方法是将偶氮烯溶解在加热的三氟乙酸中，然后用三乙胺沉淀，所得棕色粉末中含有71%的truePAz和29%的truePAz-醋酸酯复合物[30]。
据报道，PAz和truePAz均具有导电性。然而，未经处理的PAz导电率非常低，范围在10^-11至10^-10 S/cm之间。提高导电率的一种策略是阻断PAz中的1,5键，这可以通过在偶氮烯环的5位或6位引入大体积烷基来实现，从而形成平面结构的共轭链，使聚(5-异丙基偶氮烯)的导电率达到7.3 S/cm[23]。聚合后也可以增强PAz的导电性，例如，将未经处理的PAz暴露于氧气中可使其导电率提升至0.6 S/cm[26]，这归因于其氧化还原状态的改变[20]；暴露于碘蒸气中则可使导电率提高到1.2 S/cm[26]。同样的方法也可用于truePAz，使其导电率从约10^-8 S/cm提高到10^-3 S/cm[30]。此外，通过化学或电化学掺杂也能使PAz具有导电性，掺杂会改变电子分布，进而影响共轭骨架的几何结构，这一点通过红外和拉曼光谱得以体现[31]。
聚偶氮烯的合成方法及其具体条件、以及后续处理方式都会显著影响其化学和物理性质（如导电性或光学性质），也可能影响其生物性质。据作者所知，目前尚无关于PAz生物特性的研究。我们假设，PAz不仅可作为粉末使用，还可作为具有细胞调控功能的导电涂层。本研究旨在验证这一假设，不仅关注PAz的形态，还关注其制备方法。
在本研究中，PAz粉末和薄膜分别通过电化学聚合（PAzEP）[32]和化学氧化聚合（PAzCHP）[29]方法制备，同时通过阳离子聚合制备了PAz前体truePAz（[30]）。随后测定了PAz样品的物理化学性质，但本研究的主要创新点在于对其细胞相容性的评估。这不仅扩展了目前对PAz材料性质的认识，还首次提供了关于其对细胞行为影响的新信息。
聚偶氮烯的电化学合成
粉末：根据?sterholm等人（2008年）[32]的方法，使用浓度为5 mM的偶氮烯（Sigma-Aldrich，美国）和0.1 M的四丁基铵六氟磷酸盐（Sigma-Aldrich，美国）制备了电化学合成的PAz粉末（PAzEP-P）。用氩气净化溶液后，在传统的三电极单室电池中进行电化学聚合，以银丝作为参比电极
偶氮烯的电化学聚合可生成均匀的导电薄膜
偶氮烯的电化学聚合生成了PAzEP-P，实验在传统的三电极单室电池中进行，使用铂电极为工作电极（Pt WE），铂参比电极为Pt CE，以Fc/Fc+作为电位基准。通过DPV方法（图3A）观察到偶氮烯在Pt WE上的氧化过程，共识别出三个氧化峰，对应于偶氮烯转化为活性中间体的过程。图1B中的CV曲线进一步展示了这些氧化步骤随电位的变化结论
据我们所知，本研究是首次系统性地对PAz的体外细胞毒性和细胞相容性进行评估，为了解其生物性质和与细胞的相互作用提供了新见解。正如假设的那样，我们成功制备了三种不同类型的PAz薄膜，每种薄膜采用不同的合成方法获得，具有独特的结构和性质。
首先，偶氮烯的电化学聚合形成了具有中等导电性的连续薄膜
CRediT作者贡献声明
维拉·卡什帕尔科娃（Věra Ka?párková）：负责撰写、审稿与编辑、验证、方法学设计、概念构建。莱奥娜·马赫洛娃（Leona Mahelová）：负责撰写、审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、软件应用、方法学设计、实验设计、数据分析、概念构建。彼得·亨波利切克（Petr Humpolí?ek）：负责撰写、审稿与编辑、数据可视化、验证、项目监督、资源管理、方法学设计、资金申请、数据管理、概念构建。大卫·斯科达（David ?koda）：负责软件应用
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系
致谢
作者感谢捷克科学基金会（23-07425S）的支持，同时也感谢捷克共和国教育、青年与体育部（DKRVO，项目编号RP/CPS/2024-28/001）以及托马斯·巴塔大学内部资助机构（IGA/CPS/2025/001）的支持
